Эукариотты организмдерде ДНК негізінен клетка ядрларында локализацияланған; прокариоттарда ол бактериалық клетканың бүкіл хромосомасы болатын әжептеуір жинақталған нуклеоид құрайды.Митохондриялар және хлоропластар сияқты клетка органеллаларының өздерінің дербес ДНК-сы болады.Одан бөлек көптеген прокариот және төменгі эукариоттар цитоплазм асында хромосомадан тыс ДНК-лар — плазмидалар болады.
Рибосомалық, транспорттық және ақпараттық РНК-лар про- және эукариот клеткаларында цитоплазмада локализацияланған және сонда қызмет атқарады. Эукариоттарда олар клетка ядрасында синтезделеді,ядрода олардың бастамаларын табуға болады.Сонымен бірге клетка ядрасында және цитоплазмасында кіші ядролық РНК-лар болады. ДНК немесе РНК-ны құрылымдық зерттеу алдында оларды клеткадан бөліп алып, тазалап, одан соң фракциялау қажет. Нуклеин қышқылдары клеткада практика жүзінде әрқашанда белоктармен комплексте болатындықтан(яғни нуклеопротеидтер түрінде)оларды бөліп алу негізінен белоктардан тазартуға (депротеиндеуге) саяды.Көбінесе нуклеин қышқылдарын клетка гомогенаттарынан немесе тазартылған клетка органеллаларынан фенол —жүйесінде иондық детергенттер (мысалы натри й додецилсульфаты) қатысында экстракциялайды. Бұл кезде белоктар мен басқа да клеткалық компоненттер органикалық фазаға өтеді, ал нуклеин қышқылы су фазасында қалады.Сулы ерітіндіден нуклеин қышқылдарын спиотпен тұндырады.
Нуклеин қышқылдарын фракциялық бөлу әдістерінің ішінде ең кең таралғаны гельдегі электрофорез әдісі.Бұл әдісті қолданғанда кез келгенДНК немесе РНК-ны дербес күйінде алуға болады
Нуклеин қышқылдарының құрылымы.
Нуклеин қышқылдары биологиялық полимерлер класына жатады.Сондықтан ДНК және РНК –ның біріншілік құрылымы түсінігіне олардың мономерлік қалдықтарының құрылысы,мономераралық ковалентті байланыстардың химиялық табиғаты,полимер тізбектегі мономер звенолардың кезектесіп орналу тәртібі жатады.
Нуклеозидтер мен нуклеотидтер
ДНК мен РНК-ның мономер буындарына нуклеотид қалдықтары жатады. Нуклеотидтер — бұл нуклеозидтердің фосфорлы эфирлері, ал олар өз кезегінде көмірсу қалдығы — пентозадан жәнегетероциклдік негізден тұоады.
РНК-ның қөмірсу қалдығына D-рибоза ,ал ДНК— ның қөмірсу қалдығына В-дезоксирибоза жатады.Нуклеозидте көмірсу қалдығы мен гетероциклдік негіз арасындағы байланыс негіздегі азот атомы ,яғни N-гликозидтік байланыс арқылы жүзеге асады. Сонымен ДНК мен РНК-дағы нуклеозид қалдықтары N-гликозид класына жатады.
Гетероциклдік негіздерден ДНК-да екі пурин: аденин мен гуанин — және екі пиримидин: тимин мен цитозин болады. РНК-да тиминнің орнында урацил кездеседі.Сонымен қатар Кроме того, ДНК мен РНК-да минорлы деп аталатын нуклеотид қалдықтары кездеседі олар кәдімгі нуклеотидтердің негіздер немесе көмірсу қалдығы бойынша орынбасарлары болып табылады .Олардың үлесі нуклеин қышқылдарының түріне қарай проценттің оннан бірінен оншақты процентке дейін
Нуклеотидаралық байланыс . Нуклеазалар
Нуклеин қышқылдарында мономер қалдықтар бір бірімен «фосфодиэфирлі байланыстармен” байланысқан болып келеді. ДНК-да да, РНК-да да бұл байланыс бір нуклеозидтің З’-ОН тобы мен екінші нуклеозидтің 5′-ОН тобы арасында түзіледі.Сондықтан нуклеозидаралық байланысты 3’—5′-фосфодиэфирлі байланыс деп атайды. Бұдан келіп шығатыны ДНК мен РНК-ның, что полинуклеотидтік тізбектері полярлы және оның ұштары бірдей емес егер де ұшы фосфорилденбеген п-линуклеотидті қарастырсақ оның бір ұшында 5′-ОН, ал екінші ұшында — З’-ОН болады .Осы ұштарды тізбектің 5′- және 3′-ұштары деп атайды.
Нуклеотидаралық байланыстың салдарынан келіп, нуклеин қышқылдары тармақталмаған полимерлер екендігін көреміз.Тек өте сирек жағдайларда ғана (РНК биосинтезінің аралық өнімдеріне ғана қатысты) нуклеотид қалдықтарының 2′-гидроксил тобы қосымша фосфодиэфирлі байланыс түзуге қатысуы мүмкін .
Фосфодиэфир байланысының беріктігіне С2′-атоме рибозаның С2′-атомында ОН тобының болу болмауы қатты әсер етеді. Мысалы РНК-дағы нуклеотидаралық байланыстар ДНК-ғадағы қарағанда әжептеуір лабилді болады.
Клеткада ДНК мен РНК-дағы нуклеотидаралық байланыстар ерекше класс ферменттері нуклеазаларарқылы үзіледі. Бұл класс өкілдері бір бірінен әсер ету механизмі және арнайылығы бойынша ажыратылады.Нуклеазалар ішінен рестрикция эндонуклеазларын (рестриктазалар) ерекше атап өтсе болады.Бұл ферменттер ДНК молекулаларында жеке нуклеотидтық қалдықтарды емес, бес немесе алты нуклеотид қалдықтарынан тұратын тізбектерді таниды ,сондықтан кез келген ДНК-ны салыстырмалы түрде азғана фрагменттерге бөледі
ДНК мен РНК макромолекулаларының кеңістіктік ұйымдастырылуы олардың нуклеотидтік кезектілігімен анықталады ,және екінші , үшінші реттік құрылымдармен сипатталады..
Нуклеин қышқылдарының екінші реттік құрылымы нуклеотидтік тізбектердегі көрші мономер буындар арасындағы әрекеттесу арқылы түзіледі, ал екі жақты спираль молекулалар немесе молекулалар учаскелері болған жағдайда екі жақты спиральда бір біріне қарама қарсы тұрған нуклеотид қалдықтары арасындағы әрекеттесулер арқылы түзіледі.
Нуклеин қышқылдарының үшінші реттік құрылымы олардың екінші , реттік құрылымдарының әртүрлі элементтеріне жататын нуклеотид қалдықтарының арасындағы әрекеттесулер есебінен ұйымдастырылады.
ДНК-ның макромолекулалық құрылымы
1953 жылы Дж. Уотсон мен Ф. Крик, нуклеин қышқылдарының мономер қалдықтарының құрылымы туралы деректерге және Э. Чаргафф ашқан комплементарлық ережесіне, (кез келген ДНК-дағы аденин мөлшері Тимин мөлшеріне ал, гуанин мөлшері —цитозин мөлшеріне тең А = Т, G=C), сүйене отырып ДНК –ның псевдокристаллды формасының рентгенограммасының шифрын шешті .Олардың моделі бойынша, ДНКмолекуласы ортақ остен бір бірімен оралып жатқан екі полинуклеотид тізбегінен тұратын дұрыс спираль болып табылады. Спиральдің диаметрі оның ұзына бойына тұрақты және 1,80 нм-ға тең. Спиральдің сәйкестік периодына тең болатын айналым ұзындығы шамамен 3,40 нм құрайды. Спиральдің бір айналымына бір тізбектегі 10 нуклеотид қалдығы сәйкес келеді.Сонымен спираль осі бойындағы нуклеотид аралық қашықтық 0,34 нм-ге тең
Спиральдің тұрақтылығын сақтау( регулярность)үшін бір тізбектегі пуриндік негіздің қарсысында міндетті түрде екінші тізбекте пиримидинді негіз болуы шарт.спирали необходимо. Дж. Уотсон мен Ф. Крик бұл талап А негізі Т негізімен сутектік байланыспен байланысқан жұп , aл G болса С негізімен сутектік байланыспен байланысқан жұп құрғанда ғана орындалатынын тапты.
ДНК –қос спираліндегі комплементарлы негіздер основания бір жазықтықта жатады, және де бұл жазықтық спиральдің негізгі осіне әрқашан перпендикуляр жазықтықта жатады. ДНК-дағы көрші негіздер жұбы біріне қатысты бірі 360 бұрыш жасап жатады
Молекуланың көмірсуфосфатты қаңқасы сыртта жатады. Спираль айналу нәтижесінде оның беткейінде екі науашықтарлар түзіледі, үлкенінің ені 2,20 нм кішісінің ені 1,20 нм . Спираль — оң жақты бұрылған,ал ондағы полинук-леотид тізбектері антипараллель болады.Бұл ,егерде спиралы осі бойынша бір басынан екінші басына бағытталса онда бір тізбекте фосфодиэфир байланыстары 3′-*-5′, ал екінші тізбекте фосфодиэфир байланыстары5’—*-3′ бағытында болатынын көрсетеді’. Басқа сөзбен айтқанда ДНК –ның сызықтық молекуласының бір ұшында 5′-ұш ал екінші ұшында З’-ұш болады.
Кейінірек Уотсон мен Крик моделі екі жақты спиральдің бірнеше формасының бірін ғана атап айтқанда в-форма деп аталатын формасын ғана сипаттайтана белгілі болды.Бұл екі жақты спиральдік ДНК-ның негізгі формасы,клеткадағы ДНК молекулаларының көпшілігі осындай түрде кездеседі.
ДНК-ның В-формасын және оның басқа формаларына өту заңдылықтарын сипаттау үшін нуклеин қышқылдарының мономер звеноларының құрылымын және екі жақты спиральдің түзілуіне алып келетін молекулааралық әрекеттесулерді қарастырайық
Нуклеин қышқылдарының құрамына кіретін барлық 5 гетероциклдік негіздердің жазық конформациясы болады. Ал рибоза мен дезоксирибоза үшін жазық конформация ( С1, С2, СЗ’, С4′ және оттегі гетероатомы бір жазықтықта жатқан жағдай) энергетитикалық тиімсіз. Теориялық мүмкін болатын конформациялардың ішінен бұл қалдықтарда тек екі түрлі конформация жүзеге асады: не С2»-эндо-, немесе СЗ’-эндо-конформациялар ( сәйкес S- немесе N-конформациялар деп те аталады).
Нуклеотид буынының кеңістіктік құрылымының маңызды параметрі –көмірсу мен негіз қалдықтарының өзара орналасуы. Нуклеозид және нуклеотид конформацияларының теориялық анализі және рентгенқұрылымдық зерттеулер көрсеткендей, бұл жерде рұқсат етілген конформациялардың ішінде син-және аняш-конформациялар деп аталатын екі облысы болады.
ДНК –ның кеңістіктік құрылымын зерттеудің бастапқы кезеңдерінде –ақ,сыртқы жағдайлар өзгергенде екі жақты уотсон-криктік ,яғни В-формадан өзгеше болатындығы анықталды. Рентгенқұрылымдық анализге даярланған препарат үлгілерінің ылғалдылылығы өзгергенде немесе ерітіндіде судың белсенділігі өзгергенде (мысалы спирт қосқанда) ДНК А-форма деп аталатын формаға ауысады.Бұл ауысу көмірсу қалдығының конформациясының өзгеруіне байланысты. Егер де ДНК-ның В-формасында дезоксирибоза қалдығы С2′-эндо-конформация күйінде болса, А-формаға өткенде ол СЗ’-эндо-конформация күйіне өтеді.Бұл фосфат топтарының арасындағы ара қашықтықтық азаюына,сондықтан да спираль осі бойындағы нуклеотид жұптарының арасындағы ара қашықтықтықтың азаюына алып келеді. ( шамамен бір спираль айналымына 11 нуклеотид қалдықтары 0,25нм).
Спиральдің диаметрі үлкейіп науашықтардың ені мен тереңдігі өзгереді негіздер жұптары спираль осімен 20°-тай бұрыш түзеді,ең бастысы спиралтдің шетіне ығысқан болады.Осының нәтижесінде спираль қалақшалы баспалдаққа ұқсас болып,оның ішінде диаметрі 0,40 нм қуыс түзіледі.
ДНК –ның А- және В-формаларының екеуінде де спираль оң жаққа оратылған.
Кейінірек сол жаққа оратылған спиральді ДНК-лар да табылған
Ең алғаш ретсол жаққа оратылған спиральді ДНК-лар d(GC)n полинуклеотидтерінде байқалған . Поли-(dG-dC) нуклеотидтер өзара комплементарлы және төмен иондық күші бар ерітінділерде оң екі жақты спиральдар түзеді. Тұздардың жоғары концентрациясында немесе спирт қосқанда бұл екі жақты спираль сол Z-формаға өтеді. ДНК-ның Z-формасының ДНК in vivo жағдайында болу –болмауы әлі.
ДНК денатурациясы мен ренатурациясы
ДНК макромолекулалық құрылымын стабилдейтін молекулаішілік әрекеттесулердің маңызды ерекшелігіне кооперативтілік қасиеті жатады.
Комплементарлы гомополинуклеотидтерден тұратын екі жақты спиральдар үшін бұл денатурация кезінде (мысалы жоғары температуралық) спираль құрылымдардың барлық звенолары бұзылады деген сөз. Мұндай процесті екі жақты спиральдің балқуы деп атайды.Оны балқу қисығы арқылы сипаттайды, балқу қисығы өз кезегінде балқу температурасымен Тт және екі жақты спиральдің бұзылуы жүретін интервалмен сипатталады. Тек қана AT- және тек қана G-C жұптардан тұратын екі жақты спиральдердің Тт арасында 40 0С айырмашылық болады.Сондықтан табиғи А-Т-және G-C жұптарына бай ДНК-лардың балқу қисығының сипаты молекуланың ұзына бойындағы учаскелердің таралуына байланысты болады. Мұндай ДНК денатурациясы кезінде жеке ұзын сегменттердің бірге (кооперативті) балқуы жүреді.
ДНК-ның молекулалық массасы ерітіндідегі фосфат топтарының теріс зарядтарын жауып қалатын (экрандайтын) катиондар концентрациясына байланысты болады сондықтан көптеген катиондар үшін олардың концентрациясы өскен сайын Тт де өседі.