Жоспары:
1.Саузерн және Нозерн блотинг әдістері
2.Фенотиптік әдіс
Лекция мәтіні :
1.Сонымен біз қажет гені бар ДНҚ фрагментін бөліп алдық, алайда, ол әлі де болса геннің өзінен ұзындығы бойынша бірнеше нсе үлкен. Фагтық вектордың ішіне орта есеппен 15—20 мың н.ж. сиятындай етіп құрастырылатыны естеріңізде болар, ал геннің орташа ұзындығы — 1-2 мың н. ж. Міне сондықтан да жеке генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды. Гендер жинағынан бөлінгенДНҚ сегментін қайтадан әр түрлі рестриктазалармен үзеді, осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге ауыстыру басталады. Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнешн құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді. Сонымен электрофорездегі рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 109 н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды.
Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады.
Рекомбинантты ДНҚ технологиясында шоғырларды гибридизациялау әдісінен басқа қажет генді тауып анықтаудың тағы фенотиптік және иммунологиялық екі әдісі белгілі.
2.Фенотиптік әдісі ізделіп отырған геннің клетканың фенотипін шұғыл өзгертетініне негізделген. Мұндай клетка ізделіп отырған ген енбеген клеткалардан қоректік ортада өсу қабілеттілігі бойынша көзге түреді. Рекомбинантты ДНҚ-ны фенотиптік сұрыптау әдісінің бір мысалын жоғарыда рВR322 плазмидасын вектор ретінде таңбалауынан байқауға болады: қажет гені бар рДНҚ тек ампицилинді ортада ғана өсе алады, ал векторға енбеген ДНҚ-ның басқа үзінділер мұндай ортада жойылып кетеді.
Плазмидалық векторды β — галактозидаза ферментінің гені арқылы таңбалап, қажет бактериялық клонды фенотипі бойынша іріктеуге болады. Бұл ферменттің дисахарид лактозаны және оның аналогтарын ажырататынын білеміз. Аналог ретінде 5-бром —4-хлор —3-индолил — р — галактозид қосылысын алуға болады, оны генетиктер Х-гал деп атайды. β— галактозидаза одан ашық көгілдір түсті бояу — бромхлориндолды ажыратады. Плазмидаға β — галактозидазаның генін енгізіп, рДНҚ құрастыруға болады. Осы ферменттің гені жоқ Е. Соlі немесе басқа бактерияларға аталған ген бар векторды енгізіп, олар өсіп жатқан ортаға Х-гал қосса, онда ген бойынша рекомбинантты клеткалар көгілдір түсті, ал бастапқы клеткалар түссіз шоғырлар түзейді. Енді, тәжірибеде β— галактозидаза генінің арасын арнайы рестриктазаның көмегімен үзіп, орнына қажет ДНҚ үзіндісін жалғайды, мұның нәтижесінде β — галактозидаза гені активтілігін жоғалтады. Осындай рекомбинантты ДНҚ-мен трансформацияланған клеткалар қатты ортада түссіз шоғырлар түзейді, оларды бастапқывекторы барклеткалардан (көгілдір) оңай ажыратуға болады.
Иммунологиялық әдіс геннің өнімі – белок құрамымәлім болса қолданылады. Бұл әдіс белокқа антизаттар синтездей алу мүмкіндігіне сүйенеді. Алдымен рекомбинантты молекулалар бар клетка шоғырын агардың үстінде лизиске ұшырайды. Онан соң поливинил пластинкасына антизаттарды бекітіп, антиген (геннің өнімі)— антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне сәйкес белоктармен ғана байланысады. Петри шынысындағы белоктың яғни қажет геннің орнын радиоактивті элементпен (J125 т. б.) белгіленген антизаттар арқылы табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша активті гендері бар бактериялардың шоғырын табуға болады.