1. Ген инженериясында эукариот-ашытқылардың қызметі
2. рДНҚ молекуласын жануар клеткасына енгізіп, ген клонын алу
3. Генді сүтқоректілер клеткасына енгізудің тәсілдері
1. Осы уақытқа дейін біз эукариоттың ген клонын бактерия клеткасында көбеюін қарастырдық. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын тікелей эукариоттар, әсіресе сүтқоректі жануарлар клеткаларына енгізіп, оның өнімін алудың болашақтағы маңызы өте зор.
Эукариоттар клеткаларында ген клонын көбейтудің басты проблемаларының бірі — векторлық молекулалар. Генді эукариоттық векторға енгізу техникасының негізі бактериялық клеткадағыдай. Алайда, эукариоттық векторлардың өзі бактериялық векторлардан айырмашылықтары бар. Әлбетте, мұндай векторлардың рестриктазалар үзетін ыңғайлы бөліктері және таңбаланған гендері бар. Бірақ, оларды эукариоттардың плазмидасы мен вирустарының генотипі негізінде құрастырады: векторлар эукариоттық клеткаға еніп, сонда репликацияла алуы керек.Бұдан бөлек, эукариоттық клетканың ішіне түскен ген клетканың хромосомасымен байланысып, оның белгілі бөлігіне енуі қажет. Онда эукариоттық векторға осындай енуді қамтамасыз ететін элементтерді жалғау қажет болады.
Эукариоттар ген инженериясында қарапайым эукариот-ашытқының елеулі маңызы бар. Ашытқылар бір клеткалы болғанымен оларда эукариоттарды сипаттайтын барлық қасиеттер бар: цитоплазмадан ядро қабығы арқылы оқшауланған ядросы бар және ДНҚ-ның репликация, транскрипция және трапсляциясының ферменттік аппараты (оның ішінде сплайсинг ферменттері) басқа эукариоттардағыдай. Ашытқылармен генетикалық жұмыс жүргізу өте жеңіл: бактериялар сияқты сұйық ортада өсе алады, қатты ортада шоғыр түзеді, тіпті парафин, метил спирті сияқты субстраттарда да тез көбейе алады. Бұдан басқа ашытқылар геномының мөлшері үлкен емес —1,7- 107 н.ж. Ең бастысы, ашытқылар генетикалык тұрғыдан жақсы зерттелген. Ген инженериясында ашытқылар ішінен Sассhаrоmyces сerevisiae штамы ең көп қолданылады. Рекомбинантты молекулалар құрастыру үшін штамм ұзындығы 2 мкм (6300 н.ж.) тең Seр 1 плазмидасы тәжірибеге алынады. Осы плазмиданың негізінде көптеген векторлар алынды. Вектор ретінде осы плазмиданың Е. СоІі бактериясының плазмидасымен гибриді қолданылады. Мұндай ген тасығыштар өтпелі векторлар деп аталады. өйткені олар эукариоттық (мұнда ашытқы) клеткада да, прокариоттық (бактериялық) клеткада да репликациялана алады. Мұндағы бактериялық плазмиданың бөлігі векторды таңбалау үшін маңызы бар (мысалы, антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша). Осындай векторлардың көмегімен бактериялық клеткада құрастырылған рДНҚ-ны эукариоттық — ашытқы клеткасына тасымалдауға болады және керісінше.
Ашытқылар эукариоттық организм болғандықтан, олардың клеткаларында сүтқоректілердің гендері қалыпты жұмыс істей алуын күту керек еді. Алайда, бұл олай емес. Мысалы, ашытқы клеткаларында қоянның 8 — глобин генінің экспрессиясы, оның транскрипциясы мен иРНҚ сплайсингісі дұрыс өтпеуіне байланысты байқалмады. Осындай қиындықтарға қарамастан қазіргі кезде ірімшік өндіру үшін қажет химозинді, адамның интерфероны мен инсулинін және т. б. қажет белоктарды синтездейтін ашытқылар алынды.
2.Енді рекомбинантты ДНҚ молекуласын жануар клеткаларына енгізіп, ген клонын алу мүмкіндігімен танысайық. Мұнда, зерттеулер дағдыдағыдай бүкіл организмде емес, жануар клеткасының культурасында жүргізілуде. Қазіргі кезде мұндай клеткаларды, мысалы адам және сүтқоректілерұлпасыныңклеткаларын бактериямен ашұытқы сияқты сұйық және қаттыф ортада ойдағыдай көбейтуге болады. Бірақ, олар өсуі үшін әр түрлі қоректік және т.б. заттарды керек етеді. Жануар клеткаларының
жақсы өсуі үшін ортаға фетуин (— глобулин) белогына бай бұзау қанының сарысуын қосу керек. Қазір, барлық амин қышқылдар, витаминдер, өсу факторлары, тұз және глюкозалар бар толық жасанды орталар қолдану алды. Мұндай орталарда жануарлардың эмбриондық ұлпалары мен мүшелерінен (теріден, өкпеден, бүйректен, жүректен, еттен, тимус және басқа бездерден) алынған клеткаларының клондарын өсіру мүмкін болды.
Жануарлар клеткасына арналған эукариоттық векторлар кейбір вирустарға (папо-, адено , парво-, ретровирус-ар және вакцина вирусы) негізделеді. Алайда жануар вирустары геномының маңызды емес бөлігінің көлемі аз, сондықтан оларға ұзын ДНҚ фрагменттерін енгізу мүмкін болмайды. Жануарлардың кейбір гендерінің мөлшері өте үлкен (мысалы, тышқанның дегидрофолатредуктаза гені-42 мың н. ж.). Көпшілік жағдайда бөтен ДНҚ геномның маңызды бөлігінің орнын басады, нәтижесінде рекомбинанты вирустар репликация қабілетінен айырылады.
Жануарлар клеткасы үшін эукариоттық векторды дайындаудың негізгі объектісі —SV40 вирусы. Бұл, ұзындығы 5250 н. ж. сақиналы ДНҚ-сы бар кішкентай вирус мартышка (осыдан SV— simian (маймыл) virus деп аталуы) бүйрегінен бөлінді. SV40 вирусы лямбда бактериофаг сияқты иесінің клеткасының хромосомасына ене алады. SV40 вирусы негізінде бірнеше бағалы векторлар құрастырылды. Бұл векторлардың біразынан бір кемшілікті байқауға болады: олар вирионның қалыптасуына әкелгендіктен иесінің клеткасын жойып жібереді (бактериофаг сияқты). Сондықтан ғалымдар әр уақытта плазмида сияқты векторларды құрастыруғаталпынады.1970 ж. П. Берг SV40 вирусының ДНҚ-сы вирустық емесДНҚ-дан құралған гибридтіДНҚ молекуласын құрастыруды ұсынды. Ақырында ол 1980 ж. SV40вирусының ДНҚ-сы мен Е.СоІі плазмидасының ДНҚ-сынан тұратын өтпелі плазмидалық векторларды (р SV2, р SVЗ және р SV4) құрастыра алды. Бүл векторлар сүтқоректілерклеткасына генді тиімді енгізе алады. Қоянның — глобии гені ендірілген плазмидалық векторлар маймыл клеткасындакөбейе алды: тек иРНҚ ғана емес, сонымен қатар — глобиннің өзі синтезделді.
3.Рекомбинантты генетикалық материалды сүтқоректілер клеткасына енгізудің бірнеше тәсілдері белгілі. Ең қарапайым тәсіл — трансфекция немесе ДНҚ-ны клетка мембранасынан өтуін жеңілдететін күйде енгізу. Бұл үшін кальций фосфаты ерітіндісінде ген орналасқан ДНҚ фрагментін тұнбаға түсіреді. Мұндай тұнба кейбір клеткаларға еніп, өз активтілігін көрсете алады. Басқа жағдайда клеткаларды электрофорез немесе электропорация арқылы арнайы химиялық затпен (декстран ДЕАЕ) әсер етіп, оларды шоққа түсіреді, бұл ДНҚ-ның сома клеткалары ішіне енуіне (трансфекциясына) мүмкіндік береді.
Генді сүтқоректілер клеткасына енгізудің екінші тәсілі клетканың жиналған (липосомаларда, бактериялық протопластарда немесе эритроциттерде) ДНҚ-мен қосылуы. Мысалы, ДНҚ-ны липосомаға түсірсе, онда ДНҚ-ның су ерітіндісіндегі микротамшысы фосфолипидті мембрананың ішіне жиналады. Сүтқоректілер клеткасының мембранасы да фосфолипидті қабаттан құралған, сондықтан липосомалар клеткамен қосылып кетеді, яғни ген клетканың ішіне енеді.
Кейінгі кезде микроинъекция тәсілі кең қолдану алуда және оның болашағы зор. Мұнда, ДНҚ ерітіндісін шприцпен байланысқан өте жіңішке микротүтікшелер арқылы клетканың ядросына тікелей енгізеді.
Рекомбинантты ДНҚ-ны вирустардың өзін қолдану арқылы эукариоттық клеткаларға тасымалдауға болады. Бұл үшін рДНҚ-ға вирустық ДНҚ енгізу керек. Мұндай гендердің экспрессиясы ДНҚ-ны вирустарды қолданғанда жоғары деңгейде өтеді. Әрине, вектор — вирус лизистік немесе лизистік емес жолмен клондарын көбейте алады. Соңғы жағдайда вектор эписома сияқты репликацияланады.
Сонымен, біз жоғарыда баяндалғандардан жануар клеткасы үшін вектор терминінің кең түсіндірме алатынын байқаймыз. Мұнда вектор деп өзінің генетикалық активтілігін эукариоттық клеткада қамтамасыз ете алатын ДНҚ-ның кез келген тізбегін түсінеді. Жануарлар векторларына қойылатын негізгі талап — геннің клеткадағы дұрыс және тиімді активтілігін қамтамасыз ету. Эукариоттық клеткада транскрипция деңгейі, старт алу және терминация нүктесі, процессингтің дұрыс өтуі және иРНҚ-ның тасымалдануы промоторлардан басқа энхансерлерге байланысты. Сүтқоректілердің векторлары өтпелі болғаны ыңғайлы, өйткені мүндай векторларды бактериялық плазмида сияқты таңбалауға болады, немесе эукариоттық вектор селекциялық белгіні анықтайтын гендер бойынша таңбалануы қажет: рецессивті және доминантты. Рецессивті гендерді, олардың активтілігі жоқ мутантты клеткаларда ғана қолдануға болады. Доминантты гендер, өзі енген клеткаларға төзімділік қасиет береді, нәтижесінде геннің экспрессиясы байқалатын кез келген клетка үшін селекциялық таңба болып саналады.