Пероксидаза – екі компонентті фермент. Бірінші компоненті — активті топ, субстраттармен химиялық байланысқа түсетін бөлігі. Екінші бөлігі — коллоидты белокты « тасымалдаушы», осы топтың каталитикалық әсерін күшейтуші. Глобулярлы белок, диаметрі 50 Аº. Пероксидаза акцептор ретінде судың асқын тотығына әсер ететін фермент. Пероксидаза боялмаған гликопротеинді және қоңыр — қызыл феррипорфириннен тұрады.
Пероксидаза ферментінің құрылысы.
Протогемотин IX — активті орталық және судың асқын тотығының ыдырауында немесе активтенуінде негізгі рөль атқарады. Ферропротонфирин IX активті орталық құрамына кіреді және гемнің порфириндік сақинасын құрайды.
Осы парфиринді макроцикл мен белок гидрофобты әсерлесіп, нативті пероксидазаның үшінші кеңістік құрылымын құрайды. Протопорфирин гемі бар ферменттердің белоктық глобуласына маңызды тұрақтандырғыш әсер береді. Ферменттің простетикалық тобын алып тастаса пероксидазалық активтілігі жоғалады, бірақ оксидазалық қасиетті тұрақты болып қалады.
Ферменттің бірінші реттік құрылымын зерттеу желкен пероксидазасынан басталады. 1970 ж Шэннон әріптестермен /2/. Желкен тамырынан алынған пероксидазаны бес бөлік фракцияға бөлді: А1, А2, А3 В және С. Әріптестер осы пероксидазаның белоктың бөлігі 18 амин қышқылдан тұратындығын анықтады. А1, А2, А3 пероксидазалардың құрамында оксипролині бар, ал В және С — да жоқ. А — пероксидазаларда В мен С-ға қарағанда ароматтық амин қышқылдар көп болады. Әр бір пероксидаза бір полипептидтік тізбектен тұрады. Бейтарап және аминоқанттар пероксидазаның молекуласының көмірсутектік бөлігі 20% тен көп болады. Соның ішінде глюкоза, галактоза, манноза, арабиноза, фруктоза және гексозамин. Сонымен қатар айтып кету қажет, кейбір пероксидазалар изоэнзимдерінде көмірсутектік компоненттер болмауы мүмкін. Мысалы темекінің W-38 А1 және А2 изоэнзимдерінде жоқ екенін анықтайды /2/.
Пероксидаза молекуласындағы көмірсутектік компоненттердің маңыздылығы соңына дейін анықталған жоқ. Авторлар болжамы боцынша, көмірсутектер ферменттің мембрана арқылы өтуін жеңілдетеді және 3 реттік құрылымды тұрақтандырады
Өсімдіктердің жануарлардан ерекшелігі, жағымсыз әсер жерінен кете алмайды, олар оған бейімделуі қажет. Бос ИСҚ болуы өсу факторы болып саналады, сонымен қатар ИСҚ декарбоксильденуі ПО байланысты болғандықтан, өсімдіктің өсуі ПО қатысуымен жүрнді. Жоғарғыдағы пероксидазаның биохимиялық рөлін қарастыра отырып, өсуді бақылаудың екі кезеңді механизмін айқындауға болады – ИСҚ бақылау (сілтілік пероксидазалар) және клетка қабығын қатайтатын лигнин түзуші қышқыл пероксидаза. Екінші топ изопероксидазалар этилен биосинтезі арқылы байланықан. Сонымен қатар плазмалық мембрананың редокс – жүйесіне қатысуы өсу процесіне әсер береді.
Өсімдік ұлпаларының вирустар, бактериялар, саңырауқұлақтармен залалдануы пероксидазаның индукциясына әкеледі. Бұл пероксидазалық жауап қорғаныш механизмінің бір бөлігі және де бұл барлық өсімдіктерге тән. Кейбір жағдайларда (спецификалық) арнайы изопероксидазаларды анықтауға болады. Мысалы картоптың ісігінің пайда болу кезінде қышқыл пероксидазалардың түзілуі көрінген. Пероксидаза синтезінің индукциясы транскрипция сонымен қатар трансляциямен бақылануы мүмкін.Қайта синтезделетін изопероксидазалардыңфункциясы, клетка қабығының матрицасының компазмициясының өзгеруі болып келеді, ал ол өз кезегінде клетка қабығының сыртқы әсерлерден қорғауын қамтамасыз етеді. Пероксидазаның функциональды активтенуі үшін судың асқын тотығы мөлшері болып келеді. Негізінен элиситорлардың әсері сутектің асқын тотығының тез түзілуімен көрінеді. Патогеннен қорғанудың бір варианты – оған токсикалық фенолды қосылыстардың түзілуі және зақымдалудың локализациялануы.
Химиялық табиғаты бар стрестік факторларға пероксидаза жауап береді. Оны тұздың жоғарғы концентрациясы, никель мен қорғаныс иондары индукциялайды. Сонымен қатар, озонның өсімдік пероксидазасының активтілігіне тежегіштік әсер етеді. Тажа жапырақтағы пероксидаза сульфиттен сулфатқа дейін тотығуын қомтамасыз етеді, бұл пероксидазаның қорғаныс функциясыныңқышқыл жаңбырлардың әсерін детоксикалауында көрінеді. Ферменттің биохимиялық және физикалық функцияларын қорытып мына схемадан көруге болады.
Пероксидазаның қызметі, изоформалары мен субстраттары.
Пероксидазаның негізгі функциясы – химиялық қосылыстардың тотығуын Н2О2 көмегімен катализдеу. Бұл процес кезіндегі аралық комплекстер тұзіледі. 1 комплекс Н2О2 қосылғанда түзіледі де, ол тез арада 2-ші комплекске айнелады. 3-ші және 4-ші комплекстер Н2О2 аралық мөлшерде түзіледі.
E + S1→k1←k2 E1 + H2O
E1+ S2→k2 E2 + P (2)
E2+ S2→k3 E + P (3)
2P→k4P (4)
мұнда,
Е — нативті фермент, Е1 және Е2— 1 және 2 комплекстердің аралық қосылыстары,
S2 және S1 – судың асқын тотығы және оның доноры,
К – реакция жылдамдығының константасы,
P – реакция өнімі.
Фромма /2/ зерттеуі бойынша, пероксидазаның әсер ету механизмі үш субстратқа арналған реакция екенін көрсетті. Бұл жерде фенолдар екі тәуелсіз субстрат, ал асқын тотық үшінші субстрат. Осы реакцияда бос радикал пайда болады. Олар екі әр түрлі каталіздік реацияларда пайда болуы мүмкін және олар димерлерге бірігеді.
Чанс және Фредович бойынша, пероксидаза субстраттарын екі топқа бөлуге болады. Бірінші топтың субстраттары геммен байланысады, оған бейорганикалық иондар (ферроцианид, йодид, нитрид және т.б.) жатады. Екінші топ субстраттар геммен әрекеттеспейді. Оларға ароматты аминдер және фенолдар жатады. Субстраттар әр түрлігі рН мағынасының әр түрлігінде көрінеді /19/.
Пероксидазадағы жалғыз темір ионы судың асқын тотығын активтендіре қоймай, оған тотығу реакциясына қатысуына хабаршы болады. Пероксидаза каталитикалық әсері кезінде активті оттегі көзі ретінде органикалық қосылыстармен тотықтырада, соның ішінде қанықпаған май қышқылдарының тотығы және каротиндер де болуы мүмкін. Сонымен қатар ферменттің пероксидазалық қасиеті ғана емес, оның оксидазалық қасиетіде белгілі болды. Оксидазалық қасиеті бойынша фермент активті емес О2 молекуласының көмегімен біртек қосылыстарды тотықтырады.
Оксидазалық функциясының ашылуы Теорелл үлесіне тиеді. Ол кейбір өсімдіктерде тотықтыратын дигидроксифуморлы қышқылын (ДГФ) тауып, пероксидаза екенін дәлелдеп береді. Ферменттің оксидазалық функциясы әр түрлі химиялық тегі бар заттармен әсерлескенде көрінеді. Мысалы: фиороглиецин, дигидроксифумарат, гидро- және нафтогидрохинон, глютатион т.б. Оксидазалық реакцияның керекті шарты – марганец кофактор – иондары мен әр түрлі фенолдық қосылыстардың болуы. Оксидазалық функцияның пайда болуы мына субстраттарға байланысты: гидро — нафтохинондар, индолил сірке қышқылы (ИСҚ) т.б.
Қорыта айтқанда, пероксидаза әр түрлі ферменттік активтілік көрсеткендіктен, оны реттеуіш ферменттер қатарына жатқызуға болады . Сонымен қатар ол өзінің спецификалық функцияналдық топтарын коваленттік немесе иондық модификациялау арқылы активтілігін өзгерте алады. Ферменттің физиологиялық функциясының эффективті атқаруын қамтамасыз ететін факторлар: активті орталығының динамикалық құрлысы, активті орталығының жартылай функционалдылығы, пероксидазадағы жоғарғы потенциалды электрон транспортының бірнеше жолының болуы. Пероксидаза активтілігін рН ингибиторлары және активаторлары арқылы реттеу ферменттің субстратқа деген спецификалық қасиетін шектеп, көптеген болатын реакциялардың ішінен біреуінің ғана өтуіне мүмкіндік береді.
Изофермент деген ұғым пероксидазамен байанысты. Пероксидаза бір полипептид тізбегінен тұрады және жоғарғы деңгейлі молекулалық гетерогендік қасиетке ие болады. Олардың изоензимдік жиынтығы қышқылдық, бейтараптық және сілтілік түрлерден тұрады. Желкеннің пероксидазасын зерттеу кезінде анықталды. Осы ферменттің әр түрлі изоформаларының болуы белгілі амин қышқыл қалдықтарының гликолизденуіне байланысты екені.
Сонымен қатар анықталды, бөлек изопероксидазалар in vitro жағдайында әр түрлі функция атқарады, бірақ in vitro жағдайында субстраттарға ерекшелік қасиеттерінің жабу қасиетін көрсетеді. Олар өзара әсері бойынша байланысты, ал гендік құрамы бойынша әр түрлі болып келеді.
Пероксидаза субстраттары. Пероксидаза табиғаты әр түрлі субстраттарға өте кең сәйкестігінің болуы оған деген қызығушылық туғызады. Фермент және субстрат әрекеттесу реакциясына түсу үшін екі құрлымдық ерекшелікке ие болу керек.
1) ерекше химиялық байланыс, бұл ферменттің шабуыл жасау үшін
2) функционалдық топтың болуы, бұл субстраттың молекуласының активті орталықта ферменттің каталитикалық орталығына қарағанда дұрыс орналасуы үшін қажет.
Фермент – субстрат қосылысының пайда болу реациясының жылдамдығы өте үлкен және ферменттің активтілігі осы комплекстің ыдырау жылдамдығымен өлшенеді немесе Михаэлс – Ментон Кm константасымен өлшенеді. Бірақта Кm мағынасы реакцияны қандай изоэнзим катализдейді екеніне байланысты өзгеріп отырады. Соған байланысты Пенсон мен Ли пероксидазаның екі изоэнзимін жасанды (о – дианизидин және бензидин ) және табиғи ( эцгенол, кофейн және ферул қышқылдары ) субстраттары арқылы бөліп алды. Сол арқылы көрсеткендей, Кm мағынасы әр түрлі болады, қолданылған қай субстратты пайдалануына байланысты.
Кm мағынасы субстратқа қоспа реакциясының рН мөлшеріне және температураға байланысты. Егер фермент жақын субстраттардың өзгеруін катализдесе, онда әр бір субстратқа сәйкес өзіндік Кm мағынасы болады.
Сонымен қатар, филогенетикасы әртүрлі бар өсімдіктер бензидин, гваякол және пирогаллол субстраттарына тәуелділігіне байланысты бөлінеді. Ферментке жақын бояғыш субстраттар (бензидин және оның туындылары о – дианизидин және гваякол) басқа субстраттарға қарағанда изоэнзимдерді айқындауда көп қолданады.
Сонымен, пероксидаза гемі бар гликопротеид. Оның каталитикалық қасиеті Н2О2 –ға қатал сәйкес, бірақ ол субстратқа байланысты кең сәйкестік көрсетеді. Көптеген ғалымдар пероксидазаның бір активті орталығы бар деп есептейді және оның құрамына 3 валентті және валенттігін өзгертпейтін темір атомы кіреді.
Пероксидазаның қорғаныш қасиеті
Жануарлар организмінде патогендерден қорғану механизмі өте күрделі болып келеді. Бұл механизмнің негізі қорғаныш белоктардың түзілуінде. Өсімдіктерде де сондай – ақ антиденелер сияқты белоктар синтезделеді. Олар антиген –антидене принципі бойынша жұмыс атқарады. Олардың арасында сутектік және гидрофобты байланыстар түзіледі. Ондай байланыстар бір молекула ішіндегі пептидті тізбектің иондалған бөліктер арасында, әр түрлі молекулалар арасында, сонымен қатар макромолекулалар мен төменгі молекулалы органикалық және бейорганикалық иондар арасында түзілуі мүмкін. Осы соғы байланысты реакцияға қабілеті бар COOH, NH2 және SH тобы бар пероксидаза ферменті атқара алады.
Антидене ретінде әр түрлі қосылыстар болуы мүмкін, соған байланысты пероксидаза өзінің субстраттары (фенолдар, аминоқосылыстар) және судың асқын тотығы қатысуы арқылы тотығу – тотықсыздану актін жүргізе алады, қорытындысында клеткадағы қажет емес қосылыстар жойылады (утилизация). Пероксидаза патогендердің белоктарымен келесі сызба арқылы әсерлесе алады:
Пероксидазаның патогендермен әсерлесуі.
2H+ + H2O2 2I— Белок – S
Пероксидаза Белок – SI
2H2O 2I+ Белок – SH
Осы реакция арқылы пероксидаза + оның субстраты + Н2О2 организмнің қорғаныштық реациясына қатысады деп санайды. Функционалдық топтардың болуы және гликопротеидтік табиғаты пероксидаза ферментіне әр түрлі қосылыстармен ковалентті байланысуына жол ашады, ал галогендер мен Н2О2 болу кезінде антибактериоциттік комплекс құрайды.
ПО – сыртқы әсерлерге өте сезімтал келетін фермент. Функциясы жағынан ол өте лабильді, гоместаздың әртүрлі бүлінуіне әсер береді.
Стрестік фактор ретінде абиотикалық (төменгі және жоғарғы температура, сусыздану, осмас қысымы, тұздардың жоғарғы концентрациясы, токсикалық газдар) сонымен қатар биотикалық (вирустар, саңырауқұлақтар және бактериялық аурулар). Жағымсыз әсерлер аз уақытта (бірнеше минуттан сағаттарға дейін) және ұзақ (күндер, апталар) уақытқа дейін созылады. Сол кезде ПО белгілі изоформаларының активтенуінен ортақ активтенуі тіркеледі, белгілі бір изоформалардың активтенуі сонымен қатар ферменттің молекуласының конфармациясының өзгеруі көрінеді. Сонымен қатар ферменттің синтезделу жылдамдығының өзгеруі мүмкін, бір клеткалар жиынынан ферменттің екіншіге өтуі мүмкін. Клетка культурасының ПО комплексіне стрес – факторлардың әсерін зерттеуге арналған жұмыстар өте аз. Ғалымдардың айтуы бойынша тұздың жоғарғы концентрациясында ферменттің активтілігінің жоғарлауы клеткадағы бір немесе екі валентті иондардың әсерінен пероксидазаның әртүрлі компартментациясының қайта құрылуы болып саналады. Сол себепті клетка культурасына патогенез факторының әсері ПО комплексінің өзгеруін бақылайтын модельді құрлым. Қайын суспензия културасының клеткасыртылық пероксидазаның активтілігіне тот саңырауқұлағының мицелилерінің, хитозанның және хитиннің әртүрлі әсерлері зерттелген.Хитин және ммицелилер контрольмен салыстырғанда ПО активтілігін төмендетеді, бірақ клеткалардың тіршілік қабілетін жоймайды. Хитозаның 150 мкг/мл концентрациясы ПО активтілігін төмендетті, ал 300 мкг/мг концентрациясында 72 сағат әсер еткенде ферменттің активтілігінің 5 есе өсуі көрінеді және бұл жағдайда клеткалар өледі. Бұндай ұлғаю клеткалардың дегредациясы кезіндегі ПО секрециясынан пайда болуы мүмкін ал ол өз кезегінде ортадағы субстрат мөлшерінің көбеюімен байланысты. Пероксидазаның активтілігінің жоғарлауын ағзаның қорғаныштық функциясы ретінде қарастыруға болада./13/
Өсімдіктер патогенмен залалданғандағы пероксидазаның маңызы
Көптеген зерттеушілер патогенез кезінде соның ішінде саңырауқұлақтардың әсері кезінде пероксидаза активтілігі көтерілуін көрсетті. Көптеген өсімдіктерде саңырауқұлақтардың патогендеріне тұрақтылығы пероксидазаның активтілігінің көтерілуіне тура пропорционалды. Белгілі, залалданған кезде клетка мембранасымен байланысқан пероксидаза активтілігі көтеріледі, айтсақ, осы саңырауқұлақтардың кіретін жеріндегі ферменттердің активтілігі жоғарлайды. Бұл пероксидазаны өзіне тартатын саңырауқұлақтың клеткасының сыртындағы векторларының болуын көрсетеді.
Пероксидаза – полифункционалды фермент, көптеген және әр түрлі функционалды изоформалармен ерекшелінеді. Саңырауқұлақтар залалданғанда ферменттің активтенуі de novo синтезделуінен немесе бар иноформалардың көмегімен активтенуі мүмкін. Кейбір авторлардың айтуы бойынша стрест жағдайларда, соның ішінде патогендер енуінде, ферменттің сілтілік изоформалары бірінші болып активтенеді. Кейбір жағдайда өсімдіктердің саңырауқұлақтарға қарсы тұруы алдымен пероксидазаға байланысты. Белгілі, клетка қабығымен байланысқан анионды пероксидаза лигнин түзу процесіне активті қатысады, ал лигнин өсімдіктің патогендердің енуіне қарсы қорғаныс болып келеді. Инфекция кезіндегі басқа бір кедергі ол суберин. Оның синтезіне пероксидазаның қышқылдық изоформалары қатысады.
Саңырауқұлақтық патогенез кезіндегі пероксидаза активтілігін әр түрлі жолмен басқаруға болады. Ол біріншіден гормондық басқару. Өсімдік гормондарының балансының өзгеруі пероксидазаның активтенуіне немесе тежелуіне әсер етеді. Белгілі ИСҚ және АБК өсімдіктердің физиологиялық процестеріні реттелуі антигонисі ретінде қаралады және өсімдіктер клеткаларындағы пероксидаза изоформаларының активтілігінің гормондық бақылыуының механизмі ретінде көптеген ғалымдардың қызығушылығын тудырады.
Көрсетілген картоп түйіндеріндегі аниондық пероксидазаның активтілігі АБК -мен басқарылады. Салицил қышқылы жақсы зерттелген иммуномодулятор. Өлі клетканың сыртындағы пероксидазаның индукторы ретінде қызмет атқара алады.
Пероксидаза активтенуі сигнал жүйесінде негізгі болып келеді. Ол элиситорлық белгі болып және қорғаныш геннің экспресиясын, PR-белоктың, протеаза ингибиторларының, О2 активті түрін туғызады.
Fusarium туысына сипаттама
Fusarium туысындағы саңырауқұлақтар табиғатына кең таралған және олардың көбі сапрофитті болып келеді. Бірақ кейбір жағдайда олар паразитті болуы мүмкін. Олар көбіне ауыл шаруашылық өсімдіктерін зақымдайды /1/.
Топырақ Fusarium туысына жататын түрлердің табиғи таралған ортасы болып саналады (1). Топырақта Fusarium активті формада болады, өсімдіктің әр түрлі қалдықтарында, ризосферада және тамырдың үстіңгі жағында өседі. Бұл түрге жататын саңырауқұлақтар ішінде ризосфералық және тамырмекенділер көп кездеседі. Өсімдіксіз топырақта олардың саны өте аз, себебі олар басқа саңырауқұлақтар және бактериялардың бөлген антибиотиктері мен литикалық ферменттеріне өте сезімтал келеді.
Олар қоректік орта, яғни көмірсутектің көп мөлшері бар жерде жақсы өседі. Бұл саңырауқұлақтар факультативті анаэробты болып келеді. Көптеген түрлері pH мағынасының үлкен ауытқуларында да өсе алады. Сонымен қатар олар өсу барысында ортаның pH – ын өзгертуі қышқылдатуы немесе сілтіденуі мүмкін. Фузариум мезофильді саңырауқұлақтары болып есептеледі, оптимум температура 18-24-28С0. Ал температураның және рН – ың орталық көрсеткіштері шекті мағыналарында спора түзу және кейбір арнайы метаболиттердің синтезі жүреді.
Конидиялық спора түзу Fusarium түрлерінде морфологиялық және спораны түзу әдістері жағынан әр түрлі болады. Макрокондиялардың морфологиялық сәйкестік белгісі оның бір немесе екі ұшындағы сүйірленіп келуінде, аяқшалардың болуында, төменгі бөлігіндегі сарғыш секілді өсіндінің болуында.
Макроплидиялардың спорадохияларда және плонноттарда, мейелилерде, конидияносецтерде түзілуі мүмкін. Fusarium түрінің кейбіреулерінде канидиялар кәртейген кезде бөлек клеткаларға бөлініп, клетка қабығы қалыңдаған хламидоспоралар түзеді. Орта жағдай оптимальды болғанда конидиялық спара түзу үлкен қарқынмен жүреді. Бұл түрдің сәйкес ортаға көптеп көбеюіне алып келеді.
Макроконидиялар элипс тәріздес бүгілген болып келеді. Көптеген түрлеріне сәйкестік қасиет — жоғарғы клетканың біркелкі жіңішкеруі /7/.
Әр түрге жататын макроконидиялар бөліктерінің саны 3 тен 5, сирек 5 тен 7 дейін болуы мүмкін. Макрокомидиялар мен гидатердің сырты көбіне боялмаған болып келеді.
Сонымен қатар көбею және өмірін сақтап қалу маңыздылығында Fusarium кейбір түрлерінде микроконидиялар түзіледі. Олардың бөліну саны 0-1 болады.
Фузарий мицелилері де көп түрлі болып келеді. Оның дифференциясы әр түрлерде, өсіру әдісіне және өсіру жасына байланысты болады /7/.
Жоғарыда айтылғандай, бұл саңырауқұлақ фузариоз ауруын тудырады, яғни өсімдіктің клеткаларының құрылысын немесе сол клеткаға әсер ететін токсиндер, сол сияқты клетканың ядролық ақпаратын бұзады. Соның ішінде клетка құрылымын бұзып, яғни өсімдік клеткасының мембранасын ерітіп, ішке кіргеннен ауру туғызады. Осындай механизммен зақымдайтын Fusarium solani болып келеді. Ол клетка қабығын бұзу үшін көптеген ферменттер синтездейді. Мысалы: пектиназа, эндотемигалактуреназалар т.б
Fusarium solani туғызатын шірік. Саңырауқұлақтар тудыратын аурулар өсімдіктер және картоп түйінддерінде кең тарадған. Картоптың ауру тудырғыштарының түрлік құрамы, таралуы және зияндылығы, топырақтық – климаттық ерекшеліктерге, агротехниканың деңгейіне және картопты өңдеу технологиясына байланысты болады. Ауаның және топырақтың жазғы жоғарғы температурасы, ылғалдылықтың жеткіліксіз болуы, әлсіз желдер, ауаның және топырақтың температурасының кенеттен түсуі, саңырауқұлақтар тудыратын аурулардың дамуына себеп болады. Оған фитофториоз, ризоктониоз, жәй порша, құрғақ шірік және олардың аралас инфекциялары жатады /1/.
Құрғақ фузориялық шірік — ең көп таралған және зиянды картоп ауруы. Ол сақтау негізінде дамиды. Құрғақ шірік тудырушылары тілімдер мен жаралардан енеді. Әсіресе ол механикалық жинауда және сақтау орнындағы температураның тез түсуі кезінде көп болады. Ауру түйіндерде қоңырлау — ашық дақ, кішкене ішке қарай түскеннен басталып және түйіндердің жабынды ұлпасының әжімделуімен жалғасады. Түйіндегі дақтың астындағы жемісті бөлік үгімшелі, құрғақ және қышқыл қоңыр түсті болады. Зақымданған ұлпада бос кеңістік пайда болып, ақ, сары және қызыл түсті саңырауқұлақ мицелилерімен толады. Ылғалды болғанда түйін сулы консистенцияға ие болады. Ал құрғақ жағдайда түйіндер әжімделген қабықпен жабылған мумияға айналады /1/.
Сақтау кезіндегі құрғақ шіріктен шығатын шығын 15-30 % болады. Ауру түйіндер өсудің баяулауы және вегетациясы кезіндегі алдын ала салудың себебі болып саналады. Қорытындысында өнім алу 12 % және одан да көпке төмендейді. Ауру түйіндерінің ұрпақтары сырттай сау болса да, оларды сақтауда құрғақ шірікті түйіндер пайызы жоғары болып келеді.
Соған байланысты көптеген ғалымдар өсімдік және патоген арасындағы әсерлесудің молекулалық механизміне көп көңіл бөлуде. Сонымен қатар көптеген ферменттік жүйелердің активтенуімен, соның ішінде пероксидазаның активтенуін зерттейді.
ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ МЕН ӘДІСТЕРІ
ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ
Объект ретінде картоптың фузариозға төзімді Тамаша және сезімтал Santa сорттарының суспензиясы қолданылды. Fusarium solani саңырауқұлағының конидиялары, мицелилері мен оны өсірген қоректік ортаның фильртраты пайданылды.
ЗЕРТТЕУ ӘДІСТЕРІ
СУСПЕНЗИЯНЫ АЛУ ЖӘНЕ ӨСІРУ
Объект ретінде картоптың фузариозға төзімді Тамаша және сезімтал Santa сорттарының суспензиясы пайданылды. Суспензияны үгітілмелі, гомогенді Тамаша және Santa сортар каллустарынан алынды. Каллустың 2-5 г казеин гидролизаты (2 г/л), 2,4 – Д қосылған сұйық, яғни агарсыз Мурасиге – Скуга қоректік ортасына салынып айналымы мин 150 шайқағышта 24-27 оС температурада өсірілді. Өсіру циклі 6-8 күн болды. Одан кейі жаңа қоректік ортаға көшірілді (15).
Santa сорт клеткалары суспензияда біркелкі, түсі ашық жасыл болды. Оның себебі суспензиядағы клеткаларда фотосинтез процессі жүретіні және клетканың өсімталдығы жоғары екендігі. Ал Тамаша сортының суспензиязиядағы клеткалары біркелкі болмады, бұл Тамаша сортына тән қасиет болып есептеледі.
Өсімдік клеткаларының культурасы мен ұлпалары экспериментальды жүйе ретінде ғылымда көп уақыт қолданылып келеді. Бұл модельдің ұтымдылығы клеткалардың және организмдік тұрақтылық механизмдерін айыра айқындау. Сол себепті осы жұмыста патогенге тұрақтылықтары бойынша айырмашылығы бар Solanum tuberosum картобының суспензиясы қолданады.
Fusarium саңырауқұлағын өсіру
Fusarium solani саңырауқұлағы арнайы агарланған, байытылған модифицияланған Чапектың қоректік ортасында өсірлді. Чапек қоректік ортасының құрамына сахароза 30 г/л, NaNO3 2 г/л, KH2PO4 1 г/л, MgSO4 0.76 г/л, KCl 0.5 г/л, Чапек агары 20 г/л, картоп экстракты кіреді. Ал картоп экстрактісін 3:1 қатынасында қосылады. Саңырауқұлақтың бірнеше пассаждан кейін патогендік қасиеті әлсірейді. Сол патогендік қасиетін қалпына келтіру үшін Кох триадасын жүргіземіз. Ол үшін стерильденген картоп кесінділеріне саңырауқұлақ спораларын отырғызудың екі әдістемені пайдаланды. Бірінші әдістеме бойынша, картоп кесінділеріне саңырауқұлақ спораларын ілмекпен жағылады. Екінші әдістеме бойынша, саңырауқұлақ спораларын стерильденген құбыр суымен шайып алып, тығыздығын анықтап, белгілі бір мөлшерде картоп кесінділеріне құйылады. Оны Петри табақшаларына салып, стерильді жағдайда 4-6 күн өсіріледі.
Өскен мицелилерді агарланған Чапек қоректік ортасына отырғыздық. Микробиологиялық пробиркалары бөлме температурасында немесе термостатта (28оС), қараңғы жерге қойылды. Саңырауқұлақта 7-8 күннен бастап конидиялар түзіле бастайды. Түзілген конидиялар саны Фукс – Розенталь камерасында есептейлінеді. Түзілген конидияларды саны бойынша қарастыра отырып, саңырауқұлақтың өсу қисығын тұрғызуға болады.
Саңырауқұлақтың сұйық қоректік ортада өсіру. Саңырауқұлақтарды агар қосылмаған сұйық Чапека қоректік ортасында өсіреміз. Өсіру үшін микробиологиялық колбалар қажет. Қоректік ортаны колбаға 150-200 мл құйылады. Конидияларды қатты қоректік ортадан сұйық ортаға отырғызу үшін стерильденген құбыр суын пайдаланады. Құбыр суын стерильдеу үшін оны 30 минут қайнатып салқындатамыз. Микробиологиялық пробиркаға 10-15 мл су құйып, пробирка аузын парафильмді пленкамен жауып, бір минут шайқайды. Одан кейін конидилері бар суды колбаға құяды. Кейін колбаны стерильденген мақтамен жауып, аз сілкиді. Одан кейін бөлме температурасында қараңғыда 18 күн өсіріледі /1/.
Өсімдікті саңырауқулақпен залалдау
Тәжірибе үшін пассаждан кейін бір тәулік кезінде 40 мл орташа көлемінде алынды. Суспензия саңырауқұлақ мицелилерімен (су және спирт экстрактісімен), қоректік ортасының фильтратымен залалданды. Тәжірибеге алынған саңырауқұлақ 20 күндік болды. Су экстракциясы былай алынды: 3 г мицелиді 9 мл дистильденген суға салып гомагенделеді. Оны алып термостатқа саламыз. Алынған материалымыз термотұрақты болады. Спирттегі экстракті былай дайындалды: мицелилерді қатынасы 1:10 болатындай етіп 70 % спиртте экстракциялады. Картоп клеткаларының суспензиясын саңырауқұлақтың қоректіқ ортасының фильтратымен қатынасы 1:10, мицелимен 1:20 қатынасында, мицелидің судағы экстрактісімен 1:10 қатынасында, спирттегі экстрациясымен 1:10 қатынасында залалданды.
Залалданғаннан кейін 0.5, 1, 3, 6 сағаттан өткен соң пероксидаза активтілігі өлшеніп отырды.
Өсірілген Fusarium solani табиғи патогендік қасиетін қалыптастыру үшін оны арнайы Кох әдісіне қолданып дайындайды. Ол үшін картоп түйіндерінің кесінділері қажет.
Кох әдісіне қажет картоп кесінділерін дайындау. Картоп түйіндерін стерильдеу: таңдап алынған түйіндерді жақсылап жуып, KMnO4 ашық күлгін ерінтіндісіне картоп түйіндерін 5 минут салып қояды. Одан кейін екі рет дистильденген сумен жуады да 0,5 л 10 % Н2О2 ерітіндісін дайындап, 5 мин түйіндерді салынады. Дистильденген сумен үш рет жуаып, түйіндерді қабығынан тазалап, диаметрі 2 см, қалындығы 0,5 мл болатындай етіп кесіледі. Содан кейін фильтр қағазына салынған, 2-3 мл стерильденген құбыр суы құйылған, Петри табақшаларына салынады. Бір табақшаға 5-6 кесінділерден салынады.(7)
Пероксидазаның активтілігін анықтау
Залалданғаннан кейін әр колбадан 10 мл көлемінде пенецелинкаға суспензияны құйып алып отырдық. Клеткаларды дистильденген сумен 2-3 рет қоректік ортадан шацылады. Клетка сыртылық пероксидазаны экстракциялау үшін, 500 мг шприцке салып үстінен 5 мл цитратты – фосфатты буферді (0,1 М рН 6) құйып және 1 минуттан 2 рет вакуум жасаймыз. Фильтратта пероксидаза активтілігін 580 нм ұзындықта спектрофотометрде анықтаймыз. Ол үшін 0,85 мл біздің фильтратымыз, 0,5 мл цитратты – фосфатты буфер, 0,5 мл Н2О2 0,5 мл гваякол қосып тез шайқаймыз. Гваякол ферменттің бұл жердегі субстраты болып есептеледі. Сонымен қатар белокті де анықтаймыз /5/.
Клетка ішіндегі пероксидазаларды бөліп алу үшін қалған клеткаларды 2-2,5 мл ацетатты буферде (0,05 М,рН 5,6) гомагендейміз. Одан кейін 4500 айн/мин 15 минут центрифугалаймыз. Сұйықтықта цитоплазмалық пероксидазаның активтілігін қараймыз. Реакциялық қоспа құрамына 1,8 мл 0,05 М ацетат буфері, 100 мкл 64 мМ о – дианизидин ерітіндісі, 100 мкл 15 мМ сутектің асқын тотығы және 10 мкл пероксидаза экстрактісі. Реогенттерді тез араластырғаннан кейін оптикалық тығыздығының өзгеруін бақыладық. Пероксидаза активтілігін о – дианизидинді тотықтырудың алғашқы жылдамдығын бөлме температурасында 460 нм де тіркелінді. Реакцияның жылдамдығын бұрыштың тангенсі бойынша, мына формулаға саламыз:
d = Ex 2/ [C]x Valk
мұндағы,
d – пероксидаза активтілігі отн.ед./мг.мин.;
E – оптикалық тығыздықтың бір минутта өзгерісі;
[C] – белок концентрациясы, мг/мин;
Valk – алеквот көлемі;
2 – реакциялық қоспаның ортақ көлемі.
Ионмен байланысқан пероксидазаның активтілігін анықтау. Клетка қалдығы дистильденген сумен екі рет шайылып, көлем қатынасы 1:5 1 М NaCl (1:5) құйып, түнге тоңызытқышта ионмен байланысқан ферментті экстракциялау үшін қалдырамыз. Келесі күні сұйықтықта 460 нм ұзындықта пероксидазаның активтілігін акнықтаймыз. Реакциялық қосындының құрамына 1,8 мл ацетатты буфер, 100 μl 3 % Н2О2, 100 μl о – дианизидин, 10 μl белок кіреді /11/. Әр жолы белокты микробурет әдісі арқылы анықталынып отырылды.
Белокты анықтау. Белок Бенедикт реактиві қосылған микробиуретті әдіспен анықталады. Реакциялық қосындының құрамында 0,1 мл белок, 2 мл дистильденген су, 2 мл 6 % NaOH, 0,2 мл Бенедикт ерітіндісі. Қосындыны жақсылап араластырып, 15 минуттан кейін 330 нм спектрофотометрде оптикалық тығыздығын анықтаймыз. Белокты есептеу колибрлі қисықпен жүргізіледі /12/.
ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
Fusarium solani саңырауқұлағының өсу циклі
Fusarium solani – Solanum tuberosum патосистемасын зертеу үщін саңырауқұлақтың өсу циклін білу қажет. Сол себепті саңрауқұлақты агарланған Чапек ортасына отырғызып, өскеніне байланысты конидия санын саналды. Санау күнсайын жүргізілді. Соған байланысты өсу қисығы тұрғызылды.
Fusarium solani саңырауқұлағының өсу қисығы.
Бұл суретте көрінгендей скңырауқұлақта конидилардың түзілу процессі 7 күннен басталады. Конидиялардың қарқынды түзілуі 16 күнге дейін жүреді. Одан кейін азайғаны көрініп тұр. Олар көмірсутек мөлшері көп жерде өскендіктен, осы дайындалған Чапектің қоректік ортасы ыңғайлы деп санауға болады. Сонымен қатар олар мезофильді болғандықтан бөлме температурасы олардың өсуіне өте жақсы жағдай болып есептелінеді. Осы оптимальды жағдайға байланысты саңырауқұлақтың макроконидияларының көп түзілуі көрініп тұр.
Микро саңырауқұлақ болғандықтан конидидилерді микраскоп арқылы көреді және оларды санауда осы жағдайда жүргізілді. Макроконидиялар элипс тәріздес бүгілген болып келеді. Көптеген түрлеріне сәйкестік қасиет – жоғарғы клетканың біркелкі жіңішкеруі және де бөлшектерге немесе сегменттерге бөлінген. Конидиялардың бөліктенуіне байланысты олардың жас ерекшеліктерін айыруға болады, яғни жас конидиялардан кәрілерін ажыратуға болады.Уақыт өте бастап олардың бөлшектерінің саны көбее береді. Конидиялар түзілген кезде шар тәріздес болады есе келе сегменттер пайда болады. 20 күнде олар өте жақсы қалыптасып, белгілі бір формаға келеді. 5 суретте осы конидилердің өсуіндегі түр өзгерістері көрсетілген.
Fusarium solani конидиялары
Саңырауқұлақ мицелилерінің әсері
Өсімдіктің сыртқы орта әсеріне жауап беру реакциясы бірнеше процестерді қамтиды. Процестер ретінде төзімділікті индукциялайтын механизм немесе стрестік факторларға сезімталдық болып есептелді. Өсімдік клеткаларында патоген енуіне жауап ретінде клетка ішілік орналасуы бар және қарғаныш механизмінін әртүрлі этаптарында жұмыс істейтін ферменттерінің жұйелері активтенді.
Зерттелетін картоп сорттарында иондармен байланысқан пероксидаза активтілігі клетка сыртындағы пероксидаза және цитоплазмалық пероксидаза активтілігінен 5-12 есе көп болды. Залалдану әртүрлі пероксидазаның активтенуін шақырды, сортың төзімділігі мен клетка ішіндегі ферменттің орналасуына байланысты болды.
Пероксидаза полифункционалды, көптеген изоформалармен сипатталатын фермент. Сол себепті жекеленген изопероксидазалардың төзімділік механизмдердің әртүрлі қатарындағы немесе птогендерге өсімдік клеткаларының сезімталдығын зерттеуге үлкен назар бөлінеді. Патогендер пероксидаза изоформаларының құрамында әртүрлі өзгерістер туғызады. Бұл изоформалардың әртүрлі формалардың функционалды теңеместігін көрсетті. Ал бұл изоферменттік спектор иесі мен патоген системасына тән өзіндік әсерлесуіне мінездеме болып табылды.
Суспензия қатынасы 1:20 болатындай етіп мицелимен залалданды. Патогеннің әсеріне жоғарыдағы айтқандай пероксидаза изоферменттердің активтілігі әр түрлі болды. Бұны 6 суреттен көруге болады.
Мицели экстракциясының иондармен байланысқан пероксидаза активтілігіне контрольмен салыстырғанда (ТМ,SМ)1 сағ 0,5 сағ салыстырғанда активтілігі аййқын төмен түсті. Төзімді Тамаша сортында 3 сағ кецін фермент активтілігі қайтадан көтеріліп, 6 сағ төмендеуі көрінген. Ал сезімталды Santa сортында 3 сағ фермент активтілігі түсіп, 6 сағ көтеріле бастады. Цитоплазмалық пероксидаза активтілігі сезімтал және төзімді сорттарында бірдей жиілікпен өзгерді. 6 сағ пероксидаза активтілігі көтерілді.
Ал енді мицелилердің судағы термотұрақты экстракцифсының қарастырсақ, залалдау ушін картоп клеткаларының суспензиясына 1:10 қатынасында қосылды. Бұл жерде цитоплазмалық пероксидазаның активтілігі клетка сыртылық және иондармен байланысқан пероксидаза активтілігіне қарағанда жоғары болды. Цитоплазмалық пероксидаза активлігі зерттелген уақыт ішінде түсіп, 6 сағ ғана қайтадан активтілігі көтерілді. Ал иондармен байланысқан проксидаза сезімтал сортында активтілігі біртіндеп жоғарлады. Сонымен қатар төзімді сортын қарастырсақ 1 сағ фермент активтілігі көтеріліп, кейін түсіп бір шаманы ұстады. Бұған қарап төзімді сортындағы иондармен байланысқан пероксидазаның патогенге бірден жауабы деп тұжырымдауға болады. Мұның себебі бар ферменттің активтенуінен жүреді, ал сезімтал сортында фермент синтезінен кейін жауап беру жүреді.
Мицелилердің спирттегі экстракциясымен залалдау 1:10 қатынасында жүрді. Картоп клеткаларының суспензиясын залалданғанда екі сорттағы иондармен байланысқан пероксидаза активтілігі паралледі 1 сағ көтеріліп, одан кейін төмен түскені тіркелді. Цитоплазмалық пероксидаза активтілігі иондармен байланысқан пероксидаза активтілігімен өте ұқсас болды. Бұлардың мицелидің спирттегі экстракциясына жауап беруі бірдей болды.