Қазіргі ХХІ ғасырдың жетістігі – биотехнология. Биотехнология жаңалықтарын ашуға қолдан ұрықтандыру, көбею фунциясын горманаль реттеу, эмбриондар трансплантациялау салаларындағы теориялық жаңалықтар негіз болды. Көбею биотехнологиясын мал шаруашылығында қолданудың болашағы орасан зор . Көптеген елдерде бұл осы күннің өзінде комерциялық жолға қойылған. Жануарлар эмбриондарын трансплантация бойынша зоотехнияда үлкен прогресс жасалған. Бұл әдіс селеукция-асылдандыру жұмыстарында мықтап орын алды. Біз қазір трансплантация әдісінің жетілдіру өзекті мәселелерден болып қалып отыр.
Бәрімізге белгілі, Қазақстанда қайта құру кездерінде мал басы күрт қысқарып кетті. Сондықтанда, Республикада мал басын жылдам қарқында көбейту маңызды мәселелердің бірі. Донорлар дегеніміз — генетикалық бағалы ооциттер мен эмбриондар алынатын аналық мал басы.
Аталықтар деп отырғанымыз , донор аналықтарды ұрықтандыратын аталық жануарлар. Ол жануарларда аса бағалы генотипі ген, физиологиялық жағынан сау аталық қасиеті жақсы дамыған жануарлар түрінің аталықтары болуға тиіс. Демек, дәл осы сияқты жануарлар ғана мал басын көбейтуге қатысады. Жай шаруашылық жануарлары дегеніміз – генотипі бойынша онда бағалы емес, бірақ физиологияылқ жанынан дендері сау, көбею қабілеттері дұрыс жануарлар. Бұл топтағы жануарларға реципиенттер жатады. Реципиенттер дегеніміз – биотехнологиядағы бөгде эмбрионды қашан бала туып болғанша өсіретін жануарлар тобы. Жай шаруашылық жағдайларына жататынында тағы да күйттеуші аталық күйттеуіштер жатады. Күйге келген аналықтарды анықтап табуға пайдаланылатын аталық жануарлар. Олар да физиологиялық жағынан дендері сау, көбеюге қабілетті жануарлар. Эмриотрансплантация – зерттеудегі көбейту биотехнологиясы әдістерін қолдануға негізделген. Донорлар мен оларға дайындалып жатқан реципиенттер жұмыс циклының арасындағы синхрондылық сақтауға тиіс. Олар оны қозғалыс рефлексі арқылы анықтайды. Реципиент – аналықтарды дайындаудың екі жолы бар:
1) Табиғи жыныс циклдарына сәйкес келетін аналықтарды тауып алу(қой шаруашылығында қолданады).
2) Донорлар мен реципиенттер арасындағы синхрондылықты жасау үшін гормональ препараттар қолдану. Донор аналыққа 5-7 (10) реципиенттер дайындалады. Реципиенттер дайындағанда жануар түріне, тұқымына қарайды. Реципиенттер ретінде тек донорлар мен жыныс циклының синхрондылығы сәйкес аналықтар алынады. Мұндайда бірінші жұмыс сатысында теріп алынған аналықтар ішінен таңдау жүргізіледі.
Эмбриотрансплантациядағы аталықтар мен донор аналықтарды таңдау Мал шаруашылығындағы донор мен аталықтарға талап жоғары. Себебі, дәл осы жануарлардан ғана генотипі бойынша аса бағалы эмбриондар алынады. Осындай эмбриондарды пайдалану биотехнологияда аса маңызды, себебі клеткалық манипуляция in vitro былай етуге мүмкіндік береді:
а) Экстракорпораль ұрықтандырғанда – қалаған жыныстағы жануар алуға;
- b) Биокопирования арқылы- клонданған жануар алуға;
с) Трансгеноз арқылы – биохимиялық және зоотехниялық параметрлері оңай ,жануарларғы тән емес жануарлар алуға;
- d) Трансплантация кезінде – жеделдеткен түрде аса бағалы генотипті жануарларды көбейтуге;
е) Криоконсервация арқылы – гаметалар мен эмбриондар банкін жасауға;
- f) Жануарлар экспорты мен импорты кезінде – гаметалар мен эмбриондар деңгейінде алмасуға.Айтылған артықшылықтар бастапқы жұмыс этапының – донорлар мен аталықтар таңдаудың аса маңызды екенін аңғартады. Сондықтанда сұрыптаудың негізгі критерийлерінен биологиялық (түр, тұқым, жасы), физиологиялық (денсаулығы, көбейгіштігі) және зоотехниялық (өнімділігі) жануар ерекшеліктері саналады.Демек, бәсекеге қаблетті жануарлар репродукциясы биотехнология әдістері таңдап алған аиалықтар мен донор-аналықтар мынадай қасиеттерге ие болғанда ғана болуы мүмкін. Генотипті өте бағалы – ұрпақтарының сапасы бойынша тексерілген, зоотехниялық талаптар бойынша элита – рекорд класстарына жататын. Физиологиялық денсаулығы өте жақсы, инфекциялық ауруларға резистенттілігі жоғары, сонымен бірге көбею қасиеттері де тамаша.
Бір жануар тұқымына (таза өсіру кезінде).
Физиологиялық жетілген.
Жануарлар эмбриондарын трансплантациялау Эмбриондар трансплантациясы биотехнологиясы деп мына жұмыстарды жүргізуді айтады: Донорлар, аталықтар, реципиенттер таңдап алу. Таңдау кезінде негізгі крителийлерге мыналар жатады: биологиялық (жасы), физиологиялық (денсаулығы мен көбею қасиеттері), зоотехниялық (өнімділігі) ерекшеліктері.
Аналықтарды жұптау: енесі-донор мен енесі-реципиенттер. Аналықтарды жұптау кезінде қойылатын негізгі талаптар физиологиялық көрсеткіштер. Ол дегеніміз донорлар мен реципиенттердің күйге бір уақытта келуі.
Донорларды ұрықтандыру. Суперовуляцияланған донорларды ұрықтандыру кезінде олардың организмі организмі гормональ қаныққандығын еске алуымыз керек. Ондай қаныққандық келесі физиологиялық қайта құрулармен сипатталады:
1) күйге келу уақыты ұзарады;
2) овуляцияланған фолликулдар саны артады;
фолликулдар пісіп жетілуге кететін уақыт қысқарады.Сондықтанда, суперовуляцияланған донорларды ұрықтандыру кезінде мына талаптарды орындау қажет: 1) аталықтармен шағылыстырған кезде оның саны 1-ден 2-3-ке дейін көбейту қажет; 2) шағылысу интервалы 10-12 сағат болуға тиіс; 3) қолдан ұрықтандырған жағдайда спермадоза мөлшерін көбейту керек.
Эмбриондар трансплантациясына мына үш процедурадан тұрады :
Донорлар жыныс жолынан эмбриондар жуып алу.
in vitro жағдайында эмбриондарды бағалап, таңдап алу
Биологиялық толыққанды эмбриондарды реципиенттер жыныс органдарына алмастыру.
Жынысына қарай транспланттардың өсуі мен дамуын қадағалау. Бұл процесті бақылау тобындағы солармен тұтас (сверстниками) трансплантаттармен салыстыра зерттеу. Осылайша, эмбриондар трансплантациясы – бұл бір көбейтудің биотехнологиялық әдісі болып табылады. Онда донорлардан максимум толыққанды эмбриондар алып, оны реципиенттердің жыныс органдарына салып, максимум трансплантат алу.Эмбриондар трансплантациясы әдісін ойлап табуға аналықтардың мына қасиеттері себеп болды:
1.Аналық жұмыртқалықтарында өте мол ооциттердің қорының болуы.
- Эмбриондардың имплантациядан алдын еркін дамуы. Соның арқасында оларды еркін бір орнынан екінші орынға алмастыруға болатындығы.
- репродукция органдарының морфологиялық құрылысы. Соның арқасында олардағы эмбриондарды жуып алуға болатындығы.
Бұл донор – анықтан эмбриондарды реципиент-аналықтарға тасмалдау әдісі. Мал шаруашылығындағы трансплантацияның мақсаты – аса жоғары генотипті аналықтың генетикалық резервін пайдалану. Эмбриондар трансплантациясы әдісінің арқасында аналықтардың көбею мүмкіндігі артты. Себебі олардың жұмыртқалығында жұмыртқа клеткасының қоры мол. Осы үлкен генетикалық потенциальды пайдалану жөнінде эксперементтер жүргізілді. Ол жас эмбриондар генетикалық құндылығы төмен аналықтардың жыныс жолына трансплантациялау жұмыстары жүргізілді.Бұл технология мынаған қол жеткізді:
1). Бір аналықтан алынатын ұрпақ санын күрт көбейтеді;
2). Организмді гаметалара не эмбрион түрінде тасымалдауға және ұзақ уақыт сақтауға мүмкіндік береді;
3). Гаметаларалар мен эмбриондарды сұрыптау арқылы қалаған жыныста және жағымды физиологиялық – биохимиялық қасиетпен алуға мүмкіндік береді. Жоғарыда аталған технологияны орындау үшін белгілі бір іс-шаралар коплексін атқару керек. Бәрі орындалғанда эмбриондар трансплантациясы жүзеге асады. Барлық көбейту технологиясы мына жұмыстар сатысынан тұрады: донорларды, аталықтарды және рецепиенттерді сұрыптау, донорлар суперовуляциясы және донорлар мен рецепиенттер арасындағы жыныс циклын синхронизациялау, донорлары ұрықтарндыру (табиғи ұрықтандыру, қолдан ұрықтандыру), эмбриондарды жуу, алынған эмбриондарды бағалау, эмбриондарды рецепиенттер гениталийіне трансплантациялау. Мал шаруашылығандағы биотехнологияның бір әдісі болып табылады, ол жануар репродукциялық жүйесінің физиологиялық ресурстарынан мүмкіншілігін көбейтуге және оны бағалы генотипті эмбриондарды трансплантациялау арқылы көбейтуге бағытталған.Мал шаруашылығындағы эмбрионженерия, эмбриокультура және эмбриотрансплантация әдістері кешені жануарлардың селекциялық, немесе генетикалық резервін арттыруын қамтамасыз етеді.
Эмбриотрансплантация Жалпы трансплантация технологиясының ең басты құрамды бөлігінің бірі донор — аналықтардан толыққанды эмбриондарды алу. Мал шаруашылығындағы эмбриондар трансплантациясы – бұл мал көбейтудің биотехнологиялық әдісі. Мұндайда суперовуляция жасалып донор-аналықтардан максимум тіршілікке қабілетті эмбриондар алынады. Ол эмбриондар реципиент аналықтардың гениталийіне салынады.
Көбейту биотехнологиясында эмбриондарды трансплантация жолымен әдісі бірнеше деңгейге жүргізіледі:
- Іс жүзінде қолдануға тиімді эмбриондарды трансплантациялау әдістерін ойлап табу;
- Мал шаруашылығындағы эмбриодақылдық зерттеулер жүргізу;
- Мал шаруашылығындағы эмбрионженерлікзерттеулер жүргізу. Мал шаруашылығындағы эмбриондарды трансплантациялаудың мақсаты – генотипті өте жоғары мал басын жеделдете көбейту.
Трансплантация әдісінің мәнін былай түсінеміз – донор – аналықтарға гормональ әсер етіп суперовуляция жасау, оларды күйге келген кезде ұрықтандыру, ұрықтанған жұмыртқа клеткасын гениталь аппараттарынан алу, эмбриокультураль және эмбриоинженерлік зерттеулер жүргізуі (культивациялау, бағалау, селекция және тіршілікке қабілетті сұрыптап теріп алу), одан әрі оларды реципиенттер гениталийіне алмастыру.
Эмбриондарды жуып алу және алмастыру Имплантациядан алдыңғы эмбриондарды донорлар жыныс жолынан тек жуып алға ғана болады. Эмбриондар жуып алу – эмбриондарды донорлар жыныс органдарынан жуып алу, шығарып алу әдісі. Әдіс қоректік орта қолдануға негізделген. Эмбриондарды шығарып алу үшін қоректік органы не жұмыртқа жолы арқылы жіберіледі не жатыр арқылы жіберіледі
Трансплантация әдісінің артықшылығы мен кемшілігі
| № | Көрсеткіштер
|
Әдіс | |
| 1 | Қолданылу аясы | Қой және шошқа шаруашылығы | Сиыр шаруашылығы |
|
2 |
Артықшылығы | Суперовуляция деңгейін қатесіз анықтау мүмкіндігі | Биотехнолог – селекция өнердің іскерлігі мықты болған жағдайда аналықты одан әрі пайдалана беру мүмкіндігі |
| Донордан көп эмбрион жуып алуға болатындығында | Бұл әдісті қолданғанда алмастырылған эмбриондардың жабысып, одан әрі дамуы жақсы (алмастырылған эмбриондардың 35-55% жақсы жабысады) | ||
| Имплантациядан алдыңғы эмбрион дамуының әр түрлі сатысында ала беруге болады | |||
| Алмастырған кезде ипсилатор жұмыртқалық жағын оңай тауып аласың | Әдістеме қарапайымдылығымен ерекшелінеді | ||
|
3
|
Кемістігі
|
Эмбрион жабысқыштығының төменгі (ортадан төмен) (алмастырылған эмбрионның 22-35%) | Недостаточно точно определяется уровень суперовуляции |
| Жыныс жолдарында қабыну болады, соған байланысты жануарды пайдалану мерзімі қысқарады (2-3 жылға дейін)
|
Эмбриондарды тек морула, не бластоциста сатыларындағы ғана, олар жатыр мүйзіне түскеннен кейін ғана алуға болады
|
||
| Цервикаль каналының тұтастығы бұзылады | |||
| Әдістеме күрделі, қосымша финанс және еңбек шығындарын керек етеді
|
Асептика жағдайын сақтаудың қиындығы | ||
| Жуылған сұйықтан эмбриондарды тауып зерттеуге көп уақыттың кетуі эмбриондарды тауып зерттеуге көп уақыттың кетуі | |||
Мал шаруашылығында эмбрион жуудың үш әдісі қолданылады:
1) донор-аналықтарды сойып (зертханалық кеміргіштері мен қара мал шаруашылығында
2) хирургиялық (ұсақ және орташа жануарларды);
3) хирургиялық емес (ірі көлемдегі жануарларда).
Әрбір трансплантация әдісінің оңда теріс те жақтары бар. Эмбриондар жуған кезде оны үш кезеңге бөледі: Дайындық кезеңі, Жуу кезеңі және жуудан соңғы кезең. Қысқаша эмбриондар жуу әдісіне тоқталсақ, бірінші жануарларды сойып эмбриондарын алу негізінен зертханалық тышқандардан эмбрион алғанда қолданылады. Оларға басқа эмбриондарды шығарып алу әдісі қолданылуы өте сирек кездеседі.
Осы мақсатта алдымен тышқанды арнайы камерада тұндырып, не мойын омыртқасын тайдырып өлтіреді. Ал осыдан соң жыныс жолын басқа ткандардан ажыратады. Оларды керекті жерлерінен кесіп Петри табақшасына салады. Осыдан соң барып жұмыртқа жолдарынан эмбриондарын жуып алады.
Бірінші әдісті қолданғанда эмбриондарды зигота, алғашқы бөліну сатыларында жуып алса, екінші әдісті қолданғанда морула және бластоциста сатыларында жуып алады. Бірінші әдіс бойынша донорларды овуляциядан кейін 12-48 (56 ) сағат өткеннен кейін сойса, екінші әдіс бойынша овуляциядан 3-5 күн өткеннен барып сояды. Кезінде әртүрлі механикалық әсерлер жасайтын, нәтижесінде тканьдар тұтастығы бұзылатын эмбриондарды трансплантациялау әдісі –хирургиялық деп аталады.Қой мен ешкі, шошқада жыныс жолдарына трансплантация кезінде былай қол жеткізеді:
Ішінің ақ сызығы бойымен лапаротомия жасалады (вентраль- лапаротомия). Ол үшін жануар шалқасынан жатқызылады, жергілікті анестезия жалпы наркоз беріледі;
Лапаротомия жануар тік тұрған кезде жасалады. Операция аш бүйірден арнайы аспап арқылы пайдаланылып жасалады (эффеминатор);
Лапароскопия –әідіс арнайы аспап лапароскопиялық троактор қолдануға негізделген. Бекітіліп қойған (шалқасынан жатқызылып), анестезияланған іш қуысы тұсынан екі жерінен онша үлкен емес тілінеді (1,5-2 см): біріншісінен газ қоспасы үріледі (100% -СО2, үрілу жылдамдығы 1л/мин, көлемі 2,5-5 литров), ал екінші тесік гормональ индукцияланған аналықтан бірінші тесікпен бірге арнайы лапароскопиялық троактор мен канюля арқылы манипуляция жасап жұмыртқалық фолликулардан 5 мм сынап бағанынан асып кетпеуге тиіс. Ол ішке енген иненің сол қуысқа енгенін анық бақылау үшін керек.Әдісті таңдау жұмыс жүргізушіге байланысты. Бірінші әдістің кең тарағанын айтуымыз керек. Үшінші әдіс ооцитті алып in vitro ұрықтандыру үшін қолданылады. Хирургиялық тілік алу үшін екі жуу әдісі қолданылады. Осыдан соң барып эмбрион жууға кіріседі.Эмбрион жуып алу үшін екі әдісі қолданылады:
- Жатырлық. Мұндайда доғал инені жатыр мүйізінің жоғарғы ұшына сұғады да, шприцпен жуу сұйығын бифуркация бағытына жібереді;
- Жатыр –түтіктік әдіс. Бұл әдістің өзін сұйықтықты жіберу бағытына қарай тағы да екі түрге бөледі.
а) эмбриондарды жатыр мүйізінен шығарып алу, басқаша айтсақ жуу сұйығын воронкада жатыр мүйізіне қаратып жібереді (сиырлар мен шошқада);
Жануарлар эмбриондарын жуу
| № | Жұмыс этаптары
|
Жуу әдістері
|
|
| Хирургиялық (вентраль лапаротомия әдісі ) | Хирургиялық емес (трансцервикаль әдісі ) | ||
| 1
2
3
4
5
6
|
Дайындық кезеңі
Жануарды бекіту
Аурусыздан-дыру (обезболевание)
Репродукция органдарына қол жеткезетін жерді дайындау
Эмбриондар ды жуып алу
Жуғаннан кейінгі кезең |
Аш диета, 24-36 сағат бойы | Жұмыртқалықты ректаль зерттеу, сары денені тексеру: аш диета, 18-24 сағат бойы |
| Операция столында, шалқасынан жатқызып | Станокта, тұрған күйінде: тазалау клизмасы | ||
| Жалпы (наркоз) немесе жергілікті | Басында етіші 5 мл рампунь егеді, ал соңынан эпидураль анестезия жасайды (2%-тік новокаин, 10-15 мл ) | ||
| Операция жасайтын жерді сабындап жуады, жүнін қырып тастайды, 70% -тік спирітпен дизенфекцйя жасайды, 5 % -тік йод жағады. Операция жасайтын жерге жамылшы жабады. | Сыртқы жыныс органдарын сабындап жуады, ал артынан фурацилинмен жуады, 2%-тік диоцидпен дезинфикациялайды. | ||
| Ішкі жыныс органдарына қол жеткізу үшін хирургиялық тіледі | |||
| Әрбір жатыр мүйізін жууға 15-20 мл қоректік орта жұмсалады . | Әрбір жатыр мүйізін жууға 450-500 мл қоректік орта жұмсалады | ||
| Іш пен теріні кетгутпен тігеді. Жануарды операциядан кейінгі секцияға 2-3 күнге көшіреді (асқынбаған жағдайда) | Қынапқа өте аз дозада антибиотиктер ерітіндісін ендіреді (барлық уақытта емес). Жануарды бір тәуілік бойы жеке ұстайды(асқынбаған жағдайда) | ||
Қолданылып отырған жуу әдісіне байланысты эмбриондардың даму сатысы
| № | Көрсеткіштер | Эмбриондар жуу әдісі | ||
| Хирургиялық | Хирургиялық емес | Сойғаннан кейн | ||
| 1 | Жануарлар түрі | Саулық | Сыир | Зертханалық тышқан |
| 2 | Соңғы шағалысудан кейінгі эмбриондар шығарып алу уақыты | 12 сағаттан соң, 4-5 күнге дейін | 6-8 күн аралығында | 12 сағаттан соң 5 күнге дейін |
| 3 | Шығарылып алынған эмбрионның даму сатысы | Зигота – бастапқы морула | Морула — бластоциста | Зигота бластоциста |
| 4 | Жуатын сұйық жіберілетін жер | Жатыр мүйізінің негізінен жұмыртқа жолының бахромкасына қарай | Жатыр денесінен мүйізіне қарай | Жұмырқа жолының воронкасынан жатыр мүйізіне қарай |
| 5 | Эмбрионды шығарып алады | Жұмыртқа жолының бархромкасынан | Жатыр мойнынан қынап арқылы | Жатыр мүйізінен |
| 6 | Эмбриондардың алмастырғанда отырғызады — | Жұмыртқа жолына не жатыр мүйізінің негізіне | Жатыр мүйізі не денесі | Жұмырқа жолына не жатыр мүйізіне |
Жатыр мүйізінің әрбір жағына кезекпен негізінен түйрейді. Осы жерден қатетер тығылып, сол арқылы жуатын сұйық жұмыртқа жолының воронкасы бағытында жіберіледі.Әрбір жатыр мүйзін жууға 15-20 мл қоректік орта жасалады. Сол сұйықпен бірге эмбриондар пробиркаға не Петри табақшасына құйылады (эмбрионик). Оның көлемі 30мл-ге дейін жетеді. Хирургиялық эмбриондар шығарып алу Оны дереу овуляциядан кейін-ақ алуға болады (немесе күйге келген күннің ертесіне -ақ). Эмбриондар даму сатысы зиготадан бастап бастапқы морулаға дейін. Эмбриондар бұл уақытта әлі жатыр мүйізінің түбіне жетпейді. Қойдан эмбриондарды бұндай даму сату сатыларында күйге келгеннен бастап 1 күннен 5-6 күнгет дейін алуға болады.Эмбриондар жуғанда барлық механикалық әсерлер ткандар тұтастығын бұзбайтын болса-ондай әдісті эмбриондар жуудың хирургиялық емес жолы деп атайды. Ірі ауылшаруашылық жануарлардан, мысалы сиырлардан эмбрионды хирургиялық емес жолы (трансцервикальным) арқылы болады. Ол арнайы катерерлер арқылы жүзеге асырылады, оны қынап арқылы жатыр бағытында ендіру арқылы жасайды.Ізіне ректаль бақылай отырып бағыттайды. Бұлай жуған кезде катерлерді керекті жатыр мүйізіне ректаль бақылай отырып бағыттайды. Қалай катерер керекті тереңдікке дейін енген бойда баллонға 15-20мл –ге ауа сорып алады. Бұл жатыр мүйізінің кері жолын жауып қал мақсатында қолданылады. Осыдан соң жатыр мүйізіне жуатын сұйық беріледі. Эмбриондардың толық жуылуы үшін сұйықты көп керек ететінін айтып тиістіміз.Хирургиялық емес эмбриондар алу тәсілінде –эмбрион шығарып алу уақыты өте шектеулі. Жоғарыда айтылғандай хирургиялық емес әдіспен эмбрионды тек жатыр мүйізінен алуға болады. Демек, эмбриондарды олар жатыр мүйізіне түскеннен имплантация болғанынша алуға болады (дәлірек айтсақ, эмбриондар мөлдір қабықшасынан ажырағанша жақсы болады.). Даму сатыларына келсек моруладан қабықшасынан экспланцияланған бластоцистаға дейін. Сиырларда бұл эмбрион дәйкес келеді.Даму фазалары сиыр күйге келген күннен бастап 7-ші, 8-ші күндері ал, сиырларда бұл эмбрион сәйкес келеді.Осылайша эмбрион алатын уақыт қолданылып жатқан трансплантация әдісіне байланысты болады.Жоғарыда айтылғандай, эмбриондар транспплантация асылтұқымды мал шаруашылығында өз орнын мықты тапты. Ол оның әртүрлі клетка технологиясын жануарлар генотипін эмбриондар деңгейінде «конструкциялауға болатынында».Алға қойылған эмбриоинженерлік міндеттерге орай эмбриондарды in vitro манипуляция жасауға болатындай уақытта жуып алу керек. Сондықтанда, клетка технологиясына байланысты эксперимент қоярда эмбриондар жуу әдісін таңдауда тек жануар көлемі ғана емес, сонымен бірге in vitro микроманипуляцияға керекті эмбриондардың даму сатысы да маңызды роль атқарады. Мысалы, егерде эмбриондарды трансгенозды жасау керек болатын болса, онда зиготаны екі пронуклеус даму сатысында алу керек. Ондай даму саысында алу үшін соңғы шағылыстырудан кейін 12 сағатта өткеннен жуып алу керек (in vitro ұрықтандыру)
Эмбриондарды жуу кезіндегі даму сатысы мен биогеографиялық орналасу
| Индукцияланған цикл күні | «0» | «1» | «1-2» |
| Биологиялық процесс | Күйге келуі Суперовуляция Ұрықтану | ||
|
Себебі мен салдары |
Организмнің гормональ қаныққан статусы | ||
| 2-рет ұрықтан-
дыру: таңертең- кешке |
Күйге келгеннен кейін 12 сағат өткеннен бастап 24 сағатқа созылады | Овуляциядан соң 2 сағат өткеннен бастап, 24-36 сағатқа созылады | |
| Донор репродукция-лық сапасының физиология-лық ерекшеліктері. | Гармональ индукцияланған донорлардың күйге келу уақыты ұзарады, орташа 6-12 сағатқа | Суперровуляцияланған фолликулогенез мейоздың әртүрлі сатысындағы ооциттердің дамуын қамтамасыз етеді (метафаза 1-ден бастап профазы ІІ-ге дейін). Қаныққан гармональ статусқа байланысты, ұзарған экструсқа байланысты- ооциттер әр мезгілде овуляцияланады. Сондықтан жұмыртқалықтағы полиовуляциялық реакция шамада 10-24 сағатқа созылады. | Ұрықтану жұмырқа жолының ампуласында жүреді. |
| Зиготалар жуу уақыты | Соңғы шағылысудан 12 сағат өткенен кейін | Соңғы шағылысудан 24-36 сағат өткенен кейін | |
| Биогеографиялық орналасуы
|
Жұмыртқалық (овуляцияланбаған ооциттер)-жұмыртқа жолы ампуласы(овуляцияланған ооциттер). | Жұмыртқа жолы ампуласы | |
| Жуылғанда алынған ооциттер мен зиготалар популяциясы | Ұрықтанбаған ооциттер -10 % . Екі пронуклеус сатысындағы зиготалар-80 % . Жетілген зиготалар — 10 % . | Ұрықтанбаған ооциттер -1% Екі пронуклеус сатысындағы зиготалар-10 % Жетілген зиготалар-80 %. 2-бластомер эмбрион – 9 % | |
Бұл жағдайда хирургиялық емес жолмен сиырларда эмбриондар жуу жай мүмкін емес. Өйткені екі пронуклеус зигота даму сатысы жұмыртқа жолының ампуласында өтеді. Сондықтан эмбриондар жуу әдісін таңдау мына факторларға байланысты:
1) жануар түрінде қарайды;
2) жануар көлеміне қарайды (сиыр мал шарушылығында, қой мал шаруашылығында);
3) клетка технологиясына қажетті, эмбриондардың имплантациядан алдыңғы керекті даму сатысы.
Эмбриондар алмастыру Эмбриондар алмастыру репродуктивті аналық-реципиент трактына жүргізіледі. Оның екі әдісі бар: хирургиялық (зертханалық жануарлар, қой, шошқа) және хирургиялық емес (сиыр). Алмастыру кезінде істелетін жұмыстар тәртібі әдістемедегімен бірдей:
Эмбриондар алмастырудың қарапайым схемасы: а) жұмыртқа жолының воронкасына алмастырудың хирургиялық әдісі; в) жатыр мүйізіне алмастырудың хирургиялық емес әдісі эмбриондар жуу кестесінде көрсетілген. Айырмашылығы кестедегі 5 пункт, жуу деген жерде эмбриондар алмастыру болады.
Реципиенттерге эмбриондар алмастырғанда оны жұмыртқалықтың ипсилатераль жағына жасау керек (шошқаларда бұл факторды есепке алмаса да болады, себебі олардың эмбриондары миграцияға қабілетті). Ипсилатераль жағы дегеніміз жұмыртқалықтың овуляция болған жағы.
Эмбриондарды хирургиялық жолмен алмастырғанда олардың даму сатысына орай, жұмыртқа жолына, жатыр мүйзіне, денесіне алмастырса, ал хирургиялық емес әдіс бойынша-жатыр мүйзіне не денесіне алмастырады. Мұндай алмастыру мына тәртіпте жүргізіледі: алдымен жұмыртқалықта сары дене бар-жоғына қарап жұмыртқа жолының, не жатыр мүйізінің ипсилатераль жағы анықталып алады, соңынан барып эмбрион сол жаққа алмастырылады. Хирургиялық әдіс кезінде эмбриондарды жұмыртқа жолына воронка арқылы немесе жатыр мүйіз түйреп ендіреді. Эмбриондар алмастыруға арнайы иілгіш тифлон катетер қолданылады. Катетердің екінші ұшында көлемі 1-5 мл-ік шприц орнатылады.
Хирургиялық емес әдіс кезінде эмбриондар алмастыру келесі тәртіп бойынша жүргізіледі: алдымен реципиент жатырына көмірқышқыл газ үріледі, кейін эмбрионы бар пайетаны Касса катетеріне орналастырады. Одан әрі ректаль қолмен бақылап отырып, жатыр мойны арқылы жатыр мүйіз ішіне жатыр мүйзі ішінен жатыр денесінен 5-7 см тереңдікке ендіреді. Осыдан соңкатетер штогын басып, пайете ішіндегісін эмбриондармен бірге жатыр мүйзіне салып жібереді. Пайетені толтыру схемасы мынадай – 1 – қоректік орта; 2- ауа, 3-эмбриондары бар қоректік орта, 4-пайета тығыны.
Хирургиялық емес әдіс кезінде сары дененің алғашқы даму сатыларында эмбрион алмастырумен байланысты манипуляцияларды жүргізуге болмайды. Себебі, сары дене даму кезінде болатын рогестереонның жоғарғы концнетрация жатыр еттері жиырылуын төмендетеді. Ол әрине эмбриондардың тасымалдау кезіндегі жатыр мүйзіне жабысуына оң әсер етеді.
Хирургиялық емес жолмен эмбриондар алмастырғанда қолдан ұрықтандыруға пайдаланылатын аспаптар сияқты аспаптар пайдаланылады: пайетаға қоректік ортаны сорғызып алады (1,0-1,5 см), кейін ауа көпіргішін (0,5 см), одан әрі микроскоппен қарай отырып негізгі керекті эмбрионы бар қоректік ортасы сорғызылады (2-3 см), осыдан соң тағы да аздап ауа сорғызылады (0,5 см), соңынан қайтадан қоректік орта (1-1,5 см). Катетерді жатыр мүйзіне енгізген кезде механикалық тітіркеніс болдырмау мақсатында барынша абай болу керек.Шектен тыс баяу да,жылдам да болуға тиіс емес.
Теория бойынша алмастырылған эмбриондар 100 % имплантациялып, трансплантаттар тууға тиіс. Іс жүзінде эмбриондардың реципиент жыныс жолдарында өліп қалуларына байланысты ол көрсеткіш төмен болады.
Трансплантацияның оңды болуы негізінен, донор, эмбрион, реципиент арасындағы физиолгиялық, биохимиялық және иммунологиялық әерлесуге байланысты. Эмбрионның реципиент жыныс жолында өліп кетуі олардың біздер білмейтін эмбрион мен реципиент арасындағы физиолгия-биохмиялық үйлесімсіздік себеп болады. Сондықтан да эмбриондардың жақсы имплантациясы болуы үшін мына факторларды еске алу керек:
Эмбриондардың хромосомалық анатомиялары. Кing W. (1985) бойынша жуып аланған эмбриондардың тең жарымының хромосомалық аномалиялары болады екен. Донорларды осы қасиет бойынша сұраптау имплантациядан алдыңғы эмбриондар өлімін қысқартады. Одан басқа хромосомалық аномалиялар пайда болуына in vitro жағдайында эмбриондармен жүргізілетін әртүрлі манипуляциялар әсер етеді.
Имплантация кезіндегі эбриона трофобласт сигналының бәсендігі (трофиялық экто- и эндодерма). Тіршілікке қабілетті эмбриондар реципиент жатырына жыныс циклының сары дене фазасын ұзартып, буаздық сары денесіне айналдыруға сигнал береді.
Шарана мен плацента шығаратын буаздық белоктары ене қанының сары суында болып буаздықтың жалғасуын талап етеді.
Осыларға байланысты реципиент организмінде имунологиялық қайта құрулар жүреді. Эндокрин факторлары. Біз білетіндей, буаздық гармональ қайта құрулар арқылы жүзеге асады. Ол өз кезегінде жатырдың кілегей қабықтарының секреттың секреттік қасиеттері мен құрылымын өзгертеді (прогестерон, эстрогены). Аса маңызды роль атқаратын бұл жерде прогестерон гормоны. Сондықтан кейінгі даму сатыларындағы эмбриондар алмастыру жатырға жүргізіледі (морула, бластоциста) (хирургиялық емес әдісі). Осы даму сатысында жатыр прогестеронның арқасында одан ерте даму сатыларымен салыстырғанда (зигота -16-бластомер) имплантацияға аз ба, көп бе дайын болады.
Эмбриондар бекитін жеріндегі жатырдың тамырлар реакциясы. Осы кезеңде жатыр мен жұмыртқалықта қысқа мерзімді қан айналымы күшейе түседі. Бұл жатыр артерияларының жиырылу активтілігін бәсеңдетеді. Ол осы имплантация кезінде керекті эмбрионды жатырдың, басқаша организмнің біліп ,эмбриондарды реципиентке алмастыра отырып мына төмендегі тәртіпті сақтау қажет:
Донор реципиент бірінші кезекте синхронды күйге келуі тиіс. Осы шарт сақталғанда ғана реципиент жатыры дамуы мен алмастырылып отырған эмбриондар дамуы арасындағы синхрондылық, үйлесімділік сақталады. Кестеде орташа алынған сиыр мен қой мәліметтері эмбриондарды имплантациядан алдыңғы дамуын көрсетеді. Сондықтанда, эмбрион алмастырғанда «биологиялық нұсқауларға» құлақ асқан жөн, ол бірінші кезекте алмастырудың оң болуына себеп болады.Бірақта суперовуляцияланған донорлар организмінің гормональ статусы жоғары болатынын, нәтижесінде эмбриондарға арналған «биологиялық сағаттар» «үдемелі қарқында» жүретінін ескеруіміз керек. Осы үдемелі қарқын ғылыми деректерге сүйенсек 3-6 %-ті құрайды екен…
Трансплантацияға тек биологиялық толыққанды эмбриондар пайдаланылуға тиіс. Трансплантация кезінде эмбриондарды жұмыртқа жолы мен жатыр мүйізінің тек ипсилатераль жағына отырғызады.
Трансплантацияланатын эмбриондар саны жануар түріне байланысты. Жалқы туатын жануарларға екі (сирек 3), ал көп туатын жануарларға бір «патенциаль орынға» 1,5 -2 эмбрионнан отырғызады. Мал шаруашылығыда «енелік эффекті» пайдалану мақсатында тұқымаралық эмбриондар (барлақ уақытта емес) алмастыру ұсынылады.
Трансплантацияның жақсы болуының алғы шарттары мыналар Реципиент жатыры дамуы мен эмбрион дамуы сатыларының синхрондылығы. Жатыр даму сатысы мен (демек, сары дененің де) және алмастырылатын эмбриондар арасында «тығыз байланыс» болуға тиісті.
Сиыр мен қой эмбриондары, реципиенттері арасындағы физиологиялық әсерлесу
| № | Донор жыныс циклы күні | Эмбрион даму сатысы | Эмбриондардың жыныс органдарында жайлы «биографиялық орналасуы» |
| 1 | Цикл күні «0» | Аналықтың күйге келуі | Жұмыртқалықтың үштік фолликулдары |
| 2 | Циклдың бірінші күні | Овуляция | Ооцит бахромка арқлы жұмыотқа жолының ампуласына түседі |
| 3 | Соңғы шағылысудан кейін 12 сағат өткенде | Екі пронуклеус сатысындағы зигота | Жұмыртқа жолының ампуласында |
| 4 | Циклдың екінші күні | Жетілген зигота | Жұмыртқа жолының ампулоистмустық байланысында |
| 5 | Циклдың үшінші күні | 2 — бластомерлі эмбрион | Жұмыртқа жолының истмусында |
| 6 | Циклдың 4-6 күндері | Бөлінудің бастапқа сатысы (2-16-ластомерлі) | Жұмыртқа жолының жатыр – түтікшелі байланысында |
| 7 | Циклдың 7-інші күні | Бастапқы морула | жатыр мүйізінің негізінде |
| 8 | Циклдың 8-інші күні | Морула және бластоциста | Жатыр мүйізінде |
Эмриондарды сапасы бойынша тура, қатесіз бағалау.
Алмастыру әдісіне байланысты эмбриондардың жабысып, одан әрі дамып кетуі.
| № | Көрсеткіштер
|
Эмбриондарды алмастыру әдісі | |
| Хирургиялық | Хирургиялық емес | ||
| 1 | Эмбрионның даму сатысы* | Зигота, бөлінудің бастапқы сатысы | Морула, бластоциста |
| 2 | Алмастырудың биогеографиялық орыны** | истмус – жатыр мүйізінің негізі | Жатыр мүйізі |
| 3 | Дамып кету проценті*** | 35% — ке дейін | 60% — ке дейін |
Хирургиялық әдіспен морулалар мен бластоцисталар да алмастырылуы мүмкін. Себебі, ол үшін ұсақ жануарларды тек лапаротомия арқылы ғана алмастырады, бұл сол эмбриондар отырғызылатын орын болып табылады,жануар түріне қарамай орташа мәліметтер берілген. Хирургиялық емес әдіс кезінде эмбриондар алмастыру морула және бластоциста даму сатыларында жүргізіледі, ал хирургиялық әдіспен жүргізілген – зиготадан бастап, бастапқы бөліну кезінен морула, бластоцистаға дейін жүргізіле береді. Эмбриондарды кеш даму сатыларында алмастыру жақсы нәтиже бергені анықталған. Хирургиялық әдіс кезінде эмбриондардың дамып кетуіне олардың даму сатысы әсер етеді. Алмастырылған орны әсер етеді (биогеографиялық орны). Бұл дегеніміз буаздық сары денесі қаншалықты «жақсы» үлкен болған сайын жатырдың бөгде эмбрион қабылдауға дайындығы жоғары болатынын көрсетеді. Бірақта бұл болжам әлі күдікті, себебі оған қарсы да пікірлер бар. біріншіден, зигота сатысында алмастырылған эмбриондардың дамып кету дәрежесі жоғары болған да мәліметтер бар. Екіншіден, дегенерацияланған эмбриондар саны морула және бластоциста даму сатысында одан ерте даму сатысындағы эмбриондармен салыстырғанда көп болған. Мүмкін, сондықтанда кешірек сатыдағы эмбриондардың дамып кету дәрежесінің содан да болуы мүмкін.
Донорларды ұрықтандыру
Донорларды ұрықтандыруда екі түрлі әдіс қолданылады: табиғи және қолдан ұрықтандыру кезінде оларды жұптасрыту. Ал қолдан ұрықтандыруда таңдап алынған аталықты спермасын донорға арнайы аспаптармен қолдан салады. Іс жүзінде зертханалық жануарлар мен ауыл шаруашылық жануарлардың денесі шығындардан табиғи ұрықтандырады. Ал денесі ірі шаруаашылық жануарларын қолдан ұрықтандырады.
Қолдан ұрықтандыру мынаған негізделген. Ересек аталықтардың эйякулятына бір аналық клетканы ұрықтандыруға керекті сперматозоидтардан әлде неше көп болады. Сондықтанда қолдан ұрықтандырған кезде бір эякульятты бірнеше аналықтарды ұрықтандыру үшін бөліп салады. Ауылшаруашылық жануарларды қолдан ұрықтандыру мынандай технологиядан тұрады: сперманы алудан, бағалаудан, суйылтудан, сперманы организмнен тыс сақтап, соңында ұрықтандырудан. Аталықтардан сперманы жасанды қынап арқылы алады. Алынған эякулятты өңдеместен алдын мұқият зерттеуден өтеді. Эякулят көлемі ересек аталықтарды 4-8 мл болады. Ал әдетте ұрықтандыруды 0,25 -1,0 мл in vitro ғана қажет. Сондықтан қолдан ұрықтандырудың екінші сатысы жаңа алынған сперманы суйылту болып табылады. Суйылтып, одан соң қысқа мерзімде сақтауға негізіне глюкоза – цитрат сары уыз ортасы, не сүт – сары уыз ортасы қолданып, +2 – 50С-та сақталады. Сперманы алған соң 10-20-50-есе суйылтып алады. Осыдан мензуркада, 30-35 0С темпепратурада бағалау жүреді. Суйытылған сперманы 50С шамасында тоңазытылады, бұл оларды сперматозоидттар қозғалысын айтарлықтай төмендетеді. Тоңазытылған спермамен 3 күн бойы ойланбай ұрықтандыра беруге болады.
Қазақтың қой шаруашылығы технологиялық институттың зертханасында сперманы уақытша 18-24 0С градус температурада сақтаудық технолоияда жасаған. Суперовуляция жасағанда сапалы эмбриондар алу үшін донор аналықтарды ұрықтандыру маңызы зор. Ең алдымен ұрықтандыратын уақытта таңдай білу керек. Біз білетіндей сперматозоидттар ұрықтандыру қабілетіне ие болу үшін айтарлықтай уақыт аналықтардың жыныс жолында болуға тиіс.
Реципиент. Реципенттер таңдау. Аналықтарды жұптау: донор енесі мен реципиент енесі Эмбриондар трансплантациясы кезінде көбейту биотехнологиясы әдістерін қоланданғанда биологиялық (донор-аналық) және физиологиялық (реципиент-аналық) енесі болады. Донор-аналықтар мал шаруашылығында генетикалық жағынан құнды эмбриондар, ал реципиент-аналықтар алмастырылатын эмбриондарға физиологиялық, иммунологиялық және биохимиялық өсу және даму факторын жасау үшін қажет (реципиент табиғи инкубатор есебінде). Мал шаруашылығында реципиенттер пайдалануды (медицинада суррогат ене) мынамен түсіндіруге болады – біздер эмбриондар инкубациясы жағдайын in vitro әлі іске асыра алмай келеміз. Бірақ бұл реаль нәрсе, осы саладағы біліміміз жетілген кезде біз эмбриондарды зертхана жағдайында қоректік ортада да өсіретін жағдай алыс емес. Бірақта реципиенттер таңдау өте актуаль, себебі тура реципиенттерді таңдау мен жұптаудан барлық жануарларды көбейту биотехнологиясының нәтижесі шешілетін хақ. Реципиент-аналықтарды таңдау үш этапта жүргізіледі: біріншісінде жай табындағы барлық физиологиялық жетілген аналықтарды дайындайды, екіншісінде біріншіде теріп алынған реципиент-аналықтардың ішінен донор-аналықтармен эструсы сәйкес келетін аналықтарды теріп алады, ал үшінші этапта – донор-аналықтардан жуып алынған құнды эмбриондар санына қарап, соған сәйкес, эструстары донор-аналықтармен сәйкес келетін аналық-реципиент санын теріп алады. Осындай үш сатылы таңдау (таңдау) трансплантация кезінде донор-аналықтармен реципиент-аналықтардың физиологиялық синхрондылығының сақтауға мүмкін береді.
Реципиент-аналықтарды сұрыптау
| Этап | Сұрыптауға әсер ететін факторлар | Осы этаптың ерекшеліктері | Бір донорға бас есебімен |
| 1 | Зоотехникалық қойылатын талаптар | Жақсы көбейгіштік қасиеті бар, бірақ өнімділігі төмен, физиологиялық жетілген аналықтар | 30-10 |
| 2 | Жыныс циклы | Таңдап алынған реципиент аналықтар аналық-донорлармен күйге келуі синхронды | 5-10 |
| 3 | Эмбриондар саны | Тек биологиялық толыққанды эмбриондар ғана алмастырылады (аналықтың «бір орнына» 2 эмбрион алмастырылады). | 3-5 |
Донор, эмбрион, реципиент және трансплантаттардың әсерлесуі көбейту биотехнологиясында нәтиже алмастырылған эмбриондардың реципиент жатырына имплантацияланып, одан әрі одан транслантат тууына байланысты.Реципиенттерге эмбриондар алмастыру кезінде мына іс-шаралар міндетті түрде атқарылуға тиіс:
- Реципиеннтерге операция жасалып, эмбриондар салынған күні бастапқы мәліметтер журналына тіркеу жазбасы түсіріледі. Онда мына мәліметтер тіркеледі: операция күні, жеке номері, биологиялық енесінің мал жасы, алмастырылған эмбриондардың жасы мен саны, алмастырылған орыны (ипсилатераль жағы мен биогеографиялық орны).
- 2-3 күн өткенше реципиенттер бөлек орында ұсталады (асқынып кетпеген жағдайда).
- Буаздығын анықтау мақсатында 1-ші және 2-ші жыныс циклдарын байқап отырады. Егер реципиент – аналық қайта күйге келмесе, онда ол буаз болып есептеледі. Сонымен бірге, реципиенттер қанына буаздық гормондары бары-жоғына анализ де жасауға болады.Осы іс-шара атқарылғаннан соң одан әрі донор, эмбрион, реципиент, трансплантат арасындағы байланыстылықты зерттеу керек:
Мыналарға байланысты буаздық деңгейі (проценті) анықталады:
а) Эмбриондар алмастыруға пайдаланылған реципиенттер саны;
- b) Донор мен реципиенттердің мал тұқымы;
с) Донор мен реципиенттердің физиологиялық байланыстылығы (синхрондылығы),
Алмастырылған эмбриондардың мыналарға байланысты одан әрі дамып кетуі (приживляемости) деңгейі:
а) Трансплантациланған эмбриондар саны;
- b) Эмбриондардың даму сатысы;
с) Донорлар мен реципиенттерді пайдалану мерзімі (срок службы);
- d) Эмбриондар даму сатысы мен реципиент жатыры дамуы сатысы арасындағы физиологиялық байластылық.
Эмбриондардың одан әрі дамып кетуі – бұл реципиент жатырына алмастырылған эмбриондар саны мен имплантацияланған эмбриондар саны арақатынасын көрсететеін салыстырмалы көрсеткіш.. Мыналарға байланысты эмбриондардың одан әрі дамып кетуіне әсер ететін факторларды анықтау:
а) Донор мен реципиенттің қай тұқымға жатуы;
- b) Донорлар мен реципиенттердің жастары;
с) Көбею маусымы;
- d) Алмастырылған эмбриондардың даму сатысы;
е) Донор мен реципиеннің физиологиялық критерийлерінің әсерлесуі
Мыналарға байланысты транспланттардың өсуі мен дамыуна енелік эффектін анықтау:
Біріншіден, мыналарға байланысты туу нәтижесін анықтау:
а) Донор мен реципиент жыныс циклдарының синхрондылығы;
- b) Алмастырылған эмбриондардың даму сатысы;
с) Трансплантацияланған эмбриондар саны;
- d) Донор мен реципиенттің тұқымдық және жастық ұйлесімділігі.
Екіншіден, трансплантаттардың постнаталь даму кезеңінде өсуі мен дамуына, өнімділік қасиеттері қалыптасуына енелік эффектің әсерін зерттеу.